摘要

（1）Heavy metal contamination poses an escalating global challenge to soil ecosystems, with hyperaccumulators playing a crucial role in environmental remediation and resource recovery. 重金属污染对土壤生态系统构成了日益严峻的全球性挑战，超积累植物在环境修复和资源恢复中发挥着至关重要的作用。

（2）The enrichment of diazotrophs and resulting nitrogen accumulation promoted hyperaccumulator growth and facilitated phytoremediation. .固氮菌的富集和氮的积累促进了超积累植物的生长，有利于植物修复。

（3）Nonetheless, the regulatory mechanism of hyperaccumulator biological nitrogen fixation has remained elusive. 尽管如此，超积累植物生物固氮的调控机制仍不清楚。

（4）Here, we report the mechanism by which arsenic regulates biological nitrogen fixation in the arsenic-hyperaccumulator Pteris vittata. 在这里，我们报告了砷调节砷超积累植物蜈蚣草生物固氮的机制。

（5）Field investigations and greenhouse experiments, based on multi-omics approaches, reveal that elevated arsenic stress induces an enrichment of key diazotrophs, enhances plant nitrogen acquisition, and thus improves plant growth. 基于多组学方法的野外调查和温室实验表明，高砷胁迫诱导了关键固氮菌的富集，增强了植物氮的获取，从而促进了植物的生长。

（6）Metabolomic analysis and microfluidic experiments further demonstrate that the upregulation of specific root metabolites plays a crucial role in recruiting key diazotrophic bacteria. These findings highlight the pivotal role of nitrogen-acquisition mechanisms in the arsenic hyperaccumulation of Pteris vittata, and provide valuable insights into the plant stress resistance代谢组学分析和微流控实验进一步证明，特定根代谢物的上调在招募关键重氮营养细菌中起着至关重要的作用。这些发现突出了氮获取机制在蜈蚣草砷超积累中的关键作用，并为植物抗逆性提供了有价值的见解。

（7）结果

（8）Arsenic promotes nitrogen fixation in the rhizosphere 砷促进根际固氮

注：砷胁迫促进了蜈蚣草根系固氮菌的富集，从而增加了植物对氮的获取，并促进了植物生长。a：目的： 比较在不同砷胁迫下，根际土壤和非根际土壤中氮含量的差异。内容： 展示了总氮、溶解性总氮、铵盐和硝酸盐这四种氮指标。b. 根际细菌群落与砷浓度的相关性， 砷浓度是驱动根际细菌群落结构变化的关键因素。这意味着砷胁迫确实在“筛选”和改变根际的微生物种类，使其群落结构发生特异性变化。c. 根际土壤中固氮基因的丰度， 比较了低砷和高砷条件下，三个核心固氮基因的丰度。 在高砷胁迫下，所有三个固氮基因的丰度都显著更高。这表明高砷环境下的根际土壤中，具有固氮能力的微生物（固氮菌）在基因水平上确实更富集。d. 植物生长表型及生物量。e. 植物组织中的总氮含量。f. 土壤中固氮基因的绝对定量

（9）Identification of diazotrophs with nifH-Palmscan 用nifH-Palmscan鉴定固氮菌

鉴定并分析那些受砷胁迫调控的固氮微生物，它从基因序列特征和系统发育分类两个层面进行了深入解析。a. nifH 固氮酶基因的序列特征分析，目的： 展示固氮关键基因 nifH 的高度保守性，证明其作为分子标记物的可靠性。上方结构图： 以固氮菌 Azotobacter vinelandii 的 nifH 蛋白三维结构为例，直观展示该蛋白的形态。下方序列标识图： 展示了 nifH 基因对应的蛋白质序列中三个高度保守的区域（Motif A, B, C）以及它们之间的可变区（V1, V2）。“序列标识图”：每个字母代表一种氨基酸，字母堆叠的高度表示该位置氨基酸的保守程度（越高越保守）。可以看到 Motif A, B, C 区域的字母又高又单一，说明这些核心功能区域在几乎所有固氮菌中都几乎不变。 正因为 nifH 基因既有高度保守的区域（便于通过PCR等技术进行检测和寻找），又有可变区域（便于区分不同种类的固氮菌），所以它被广泛用作识别和鉴定环境中固氮微生物的 “分子条形码”。本研究的后续分析都是基于这个基因进行的。

b. 受砷胁迫调控的固氮菌系统发育树，目的： 全面展示哪些种类的固氮菌受砷胁迫影响，以及它们是如何变化的。内容解读： 这张图是一个环状的系统发育树，从内到外有多层信息：树的分支（基础）： 每一个分支代表一个不同的 nifH 基因序列，也就是代表一种（或一类）固氮微生物。它们根据基因序列的相似性被排列，亲缘关系越近的分支距离越近。分支颜色（最内圈信息）： 将所有的固氮菌分成了经典的 I 到 VIII 共8个进化群。条形图（核心发现）： 这是该图最关键的部分。 树外围的条形显示了该固氮菌在高砷胁迫 vs. 低砷胁迫下的变化情况。红色条形：表示该固氮菌的 nifH 基因在高砷胁迫下显著上调（富集）。蓝色条形：表示该固氮菌的 nifH 基因在高砷胁迫下显著下调（减少）。条形长度：代表变化幅度的大小。绿色标签： 特别标出了那些变化具有统计学显著性的分支。外层圆圈（分类信息）： 从内到外依次展示了这些固氮菌的域、门、纲、目级别的分类学信息。砷胁迫显著改变了根际固氮菌的群落结构。它不是一个随机的过程，而是有选择性地富集了某些特定的固氮菌类群（主要是那些带有显著红色条带的分支）。通过外层的分类信息可以看到，被显著富集的固氮菌主要属于 变形菌门，特别是 α-变形菌纲 和 γ-变形菌纲 等。这直观地揭示了 “砷胁迫诱导关键固氮菌富集” 这一现象的具体对象是哪些。

（10） 

Rhizospheric diazotrophs enhance arsenic oxidation and plant growth 根际固氮菌促进砷氧化和植物生某些同时具备耐砷和固氮能力的特定细菌，能够促进蜈蚣草的生长。

（11） Chemoattractant effects of arsenic-regulated rhizospheric metabolites on diazotrophs 砷调控的根际代谢产物对固氮菌的趋化作用

蜈蚣草如何通过改变其根系分泌的代谢物，来精准地招募关键固氮菌。a. 根际代谢物组的变化.条形图（Log Fold Change）： 显示了三大类代谢物（碳水化合物、α-氨基酸、黄酮类化合物）在高砷 vs. 低砷根际中的整体变化趋势。条形的颜色（紫色）表示这种整体变化是显著的。三角形标记（与本体土壤对比）：橙色三角：标记出在高砷根际中，相对于其旁边的非根际本体土壤显著富集的特定代谢物。绿色三角：标记出在高砷根际中，相对于本体土壤显著耗尽的特定代谢物。这通常意味着这些物质被微生物快速消耗利用了。蓝色圆点（植物体内变化）： 标记出在高砷胁迫下，在植物体内也同步上调的代谢物。发现： 高砷胁迫特异性地改变了根系分泌物的组成，特别是富集了某些氨基酸和黄酮类物质。这些物质很可能是吸引固氮菌的“信号”或“食物”。

b. 关键代谢物——儿茶素的定量验证，目的： 从图a发现的众多代谢物中，聚焦并验证一个关键信号分子——儿茶素。内容解读：左侧（非靶向代谢组学）： 展示了儿茶素在野外采集的不同样本（本体土、根际、植物体内）中的信号强度。可以清晰看到，在高砷胁迫下，根际和植物体内的儿茶素信号都显著增强。右侧（靶向代谢组学）： 通过更精确的定量方法，在温室受控实验中证实，加砷处理确实导致了根际土壤中儿茶素浓度的显著升高。c. 代谢物对固氮菌的趋化性吸引， 直接验证像儿茶素这样的代谢物是否能主动吸引固氮菌。使用微流控芯片模拟根际环境，观察两种关键的固氮菌是否会朝着含有特定代谢物的方向移动。

（12） Contribution of arsenic to enhancing nitrogen fixation 砷对提高固氮作用的贡献

同位素示踪实验，直接量化了生物固氮对蜈蚣草氮营养的实际贡献，并证明了合成菌群的有效性。a:¹⁵N₂ 气体标记。图中的 “10% ¹⁵N₂” 是关键。这意味着研究人员创造了一个人工大气环境，其中氮气（N₂）中 ¹⁵N 同位素的丰度被提高到 10%（自然环境中仅为约 0.366%）。目的：为空气中的氮气打上一个独特的、高浓度的“标签”。任何固定了这种被标记的氮气的生物，其体内都会带有这个高 ¹⁵N 的信号。实验分组：Control (对照)：无砷胁迫，未接种合成菌群。这是在最自然状态下的基线组。As (砷暴露)：有砷胁迫，但未接种合成菌群。用于测试砷胁迫本身对固氮的效应。Inact. Inoc. (灭活接种)：有砷胁迫，接种了被灭活的合成菌群。Inoc. (接种)：有砷胁迫，接种了活的合成菌群。这是关键的实验组，用于测试功能菌群的最大效能。直接追踪大气中的氮气是否、以及有多少被固定并进入了植物体内。

上半部分：δ¹⁵N 值：δ¹⁵N 是什么？ 它是衡量样品中 ¹⁵N 同位素相对于标准物质富集程度的指标。柱子的高度越高，表示植物组织中的 ¹⁵N 越富集。柱子的高度越低，表示植物组织中的 ¹⁵N 越贫乏（即更接近大气的自然本底值）。

下半部分：生物固氮贡献率 这是根据 δ¹⁵N 值的数据，直接计算出的生物固氮为植物提供的氮占总氮量的百分比。Control组：贡献率很低，说明在正常情况下，生物固氮不是主要氮源。As组 (仅加砷)：贡献率显著提升，达到约 40% (根) 和 25% (茎)。这是一个巨大的飞跃，证明了砷胁迫在生态生理学上的关键作用。Inoc.组 (接种活菌)：贡献率达到惊人的 ~65% (根) 和 ~55% (茎)。这雄辩地证明了人工接种筛选出的高效菌群，可以最大化地发挥植物的固氮潜能。

（13）Method

Metabolomic analyses 代谢组分析  

To recognize key rhizosphere metabolites in response to stress, both targeted and untargeted metabolomics approaches were applied to detect metabolites in soil and plant roots. For untargeted metabolomics analysis, 50 soil samples (5 g each of bulk and rhizosphere soil) and 25 root samples (200 mg) were collected from 25 wild Pteris vittata plants and proportionally extracted using pre-cooled acetonitrile: methanol: H2O (2:2:1, v/v/v). This mixed solvent system was selected with the aim of enhancing the extraction efficiency of compounds with varying polarities, effectively penetrating cell membranes, preserving metabolite stability, and ensuring compatibility with mass spectrometry for high-quality spectral data acquisition. After centrifugation at 10,000 × g for 10 min, the supernatant was harvested for LC-MS/MS measurement. Quality control (QC) samples were prepared by pooling equal aliquots from all samples collected. One QC sample was injected prior to the analysis and after every ten runs to assess the analytical variance. Untargeted metabolomics was performed with Vanquish UHPLC system fitted with a Q Exactive HF-X mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific, USA). For targeted metabolomics analysis, 100 mg of rhizosphere soil were collected from Pteris vittata grown in control (n = 6) and As-amended soil (n = 6) and extracted with 70% MeOH. The targeted metabolomics analysis was conducted with QTRAP 6500+ system (SCIEX, USA). Both chromatographic analyses were conducted using a Waters ACQUITY UPLC HSS T3 column (1.8 μm, 100 mm × 2.1 mm). While this approach satisfies the requirements of our research, it is important to recognize that relying solely on a C18 column for broad-spectrum untargeted metabolite separation and identification has its limitations, potentially impacting the detection of molecules with extreme hydrophobicity and high polarity. Detailed parameters of the collection and detection for metabolites in targeted and untargeted metabolomics are provided in Supplementary Information.

为识别响应胁迫的关键根际代谢物，本研究采用靶向和非靶向代谢组学方法检测土壤和植物根系中的代谢物。在非靶向代谢组学分析中，从25株野生蜈蚣草植株采集了50份土壤样本（每份5克，含本体土壤和根际土壤）和25份根系样本（每份200毫克），并使用预冷的乙腈:甲醇:水（2:2:1, v/v/v）按比例进行提取。该混合溶剂体系经优化选择，旨在提高不同极性化合物的提取效率，有效穿透细胞膜，保持代谢物稳定性，并确保与质谱分析的兼容性以获得高质量谱图数据。经10,000×g离心10分钟后，收集上清液进行LC-MS/MS检测。质控样本通过等量混合所有采集样本的提取液制备而成，在分析序列开始前及每检测10个样本后插入一个质控样本以评估分析误差。非靶向代谢组学分析采用配备Q Exactive HF-X质谱仪的Vanquish超高效液相色谱系统。靶向代谢组学分析则从对照组（n=6）和砷处理组（n=6）栽培的蜈蚣草根际采集100毫克土壤样本，用70%甲醇提取后，使用QTRAP 6500+系统进行分析。两类色谱分析均采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（1.8 μm, 100 mm × 2.1 mm）。虽然该方法满足本研究需求，但需注意仅依靠C18柱进行广谱非靶向代谢物分离鉴定存在局限性，可能影响极高疏水性和高极性分子的检测。靶向与非靶向代谢物采集检测的详细参数见补充信息。

Key metabolite identification 关键代谢物鉴定 

The R package Ropls76 (v1.22.0) was used for scaling and multivariate statistical analyses of all normalized MS data. In detail, adaptive scaling transformation was employed to scale the data, followed by Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis (OPLS-DA) to recognize differential metabolites between between the pairwise sample groups. Consequently, we conducted four pairwise comparisons among the sample groups, corresponding to criteria 1-4 mentioned above: R软件包Ropls76 (v1.22.0)用于所有标准化MS数据的缩放和多元统计分析。具体而言，采用自适应缩放变换来缩放数据，随后采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)来识别两两样本组之间的差异代谢物。因此，我们在样本组之间进行了四个成对比较，对应于上述标准1-4: 

1. high-arsenic rhizosphere soil vs. high-arsenic bulk soil. 1.高砷根际土壤与高砷块状土壤。 

2. high-arsenic rhizosphere soil vs. low-arsenic rhizosphere soil. 2.高砷根际土壤与低砷根际土壤。 

3. high-arsenic bulk soil vs. low-arsenic bulk soil. 3.高砷散装土壤与低砷散装土壤。 

4. high-arsenic root vs. low-arsenic root. 4.高砷根与低砷根。