证明了大豆单作的自我修复能力

Long-term continuous cropping reshapes soybean rhizosphere microbiome and metabolome to alleviate allelopathic stress and enhance disease suppression 长期连作改变了大豆根际微生物群和代谢群，以减轻化感胁迫和增强病害抑制

摘要

（1）Continuous cropping obstacles (CCO) pose a persistent threat to global soybean sustainability, yet paradoxically attenuate under prolonged monoculture. To explore this, we investigated the soil–plant-microbiome dynamics across 1-year, short-term continuous cropping (STCC, 7–13 years), and long-term continuous cropping (LTCC, 19–25 years) systems. 连作障碍(CCO)对全球大豆可持续性构成持续威胁，但矛盾的是，在长期单一种植下，这种威胁会减弱。为了探索这一点，我们调查了一年、短期连作(STCC，7-13年)和长期连作(LTCC，19-25年)系统的土壤-植物-微生物动态。

（2）Our results reveal that LTCC reduces the accumulation of allelopathic autotoxin by 49.06% (P<0.05) and enriches beneficial rhizosphere metabolites (e.g., antibiotics, monoterpenes, and glycoside compounds), driving a shift in the microbial community towards taxa with pathogen-suppressive and nutrient-cycling functions. 我们的研究结果表明，LTCC减少了49.06%的化感作用自毒素积累(P < 0.05)，并丰富了有益的根际代谢物(如抗生素、单萜和糖苷化合物)，推动微生物群落向具有病原体抑制和养分循环功能的类群转变。 

（3）LTCC cultivated a microbiome with enhanced genes for stress resistance and nutrient uptake. Conversely, STCC exacerbates CCO stress, with microbial dysbiosis peaking at 13 years (Simpson index down 15.4%). LTCC培育了一个微生物群，增强了抗压力和吸收营养的基因。相反，STCC加剧了CCO压力，微生物生态失调在13年达到顶峰(辛普森指数下降了15.4%)。

（4）Notably, 25-year LTCC restores ecosystem stability and enzyme activity, restructuring microbial communities with pathogen-suppressive and nutrient-cycling functions.  By reintroducing depleted taxa including Pseudomonas, Burkholderia, and Enterobacter spp., we constructed a synthetic community, SC7. SC7 boosted soil enzymes and root nodules to shield plants from stress, increasing yield by 4.83% and mimicking long-term system advantages. 值得注意的是，25年长期保护性耕作（LTCC）恢复了生态系统稳定性和酶活性，重组了具有病原菌抑制与养分循环功能的微生物群落。通过重新引入包括假单胞菌属（Pseudomonas）、伯克霍尔德菌属（Burkholderia）和肠杆菌属（Enterobacter）等已耗竭的类群，我们构建了一个合成菌群SC7。SC7能够提升土壤酶活性并促进根瘤形成，从而增强植物抗逆能力，使作物增产4.83%，成功模拟了长期保护性耕作体系的生态优势。

（5）This study demonstrates the self-repair capacity of soybean monoculture. It bridges the gap between mechanistic insights, specifically the microbiome–metabolite feedback, and actionable solutions, such as SC7 inoculation. As a result, it advances sustainable intensification strategies for global soybean production. 本研究证明了大豆单作的自我修复能力。它弥合了机械见解(特别是微生物群-代谢物反馈)和可行解决方案(如SC7接种)之间的差距。因此，它推进了全球大豆生产的可持续集约化战略。

（6）Result

图1a：从实际的大豆田里，分别取来了种过 1年、7年、13年、19年、25年 大豆的土壤。把这些不同“病史”的土壤装进花盆，再种上新的大豆。看看在这些“老病号”土壤里，新大豆苗长得怎么样，并记录它们的健康状况（生理指标）。这就像把不同患病程度的病人放在一起，观察他们的症状有什么不同。

图1b：给土壤做“全面体检”在大豆开花时，取了它根部附近的土壤（根际土壤，这是微生物活动的“主战场”），然后做了三件事：测“消化功能”：化验土壤酶活性，看土壤分解养分的能力好不好。查“菌群档案”：提取土壤DNA，进行微生物分析，看看里面住着哪些好细菌、哪些坏细菌。验“代谢产物”：进行代谢物鉴定，看看土壤里是毒素多，还是有益的营养物质多。

图1c：配制“益生菌药方”，找“好细菌”：从种了25年、已经“康复”（CC25）的健康土壤里，分离出活的细菌。在实验室里（体外）测试它们有没有促进植物生长的能力。在植物身上（体内）测试它们能不能帮助植物抵抗病害。组“特战队”：把筛选出的最有效的几种细菌（比如前面提到的假单胞菌、伯克氏菌等），组合成一个 “合成菌群”。做“临床试验”：把这个配制好的“益生菌药方”（SynComs），先在温室（Greenhouse），再到大田（Field）进行试验，看它到底能不能治病增产。

（7）Contrasting Plant Performance between STCC and LTCC短期连作与长期连作条件下植物表现的对比

连作年限（CC）从1年、7年、13年、19年到25年，关键转折点出现在13年左右，之后植物反而长得更好了。图a：整体生长性状对比，分别种在CC1（1年）到CC25（25年）的土壤里。最差的一组：CC13（种了13年的土壤） 里的大豆长得最矮小、最弱。由差变好：过了这个坎，CC19和CC25 土壤里的大豆长得明显更高、更壮，甚至比只种了1年（CC1）的还要好。

图b：早期关键指标（播种后7天），出苗率：从CC1到CC13，出苗率越来越低，在CC13降到最低（约50%）。之后在CC19和CC25大幅回升到接近90%。变化趋势和出苗率完全一致，也是在CC13最矮，在CC19/25恢复到最高。

图c：叶绿素含量：CC1最高，CC13最低，之后（CC19/25）显著回升。

图d：株高和茎粗：这两个是衡量植物长得壮不壮、结不结实的最直接指标。

株高：CC7最高，CC13大幅下降，之后又回升。说明CC13严重抑制了生长速度。

茎粗：最关键的发现！CC25的茎是最粗的，显著超过了CC1和CC13。

（8）Metabolic Reprogramming from STCC to LTCC从短期连作到长期连作的代谢重编程

在“病重期”（短期连作，STCC）：积累了有毒物质，植物防御和有益信号分子减少。在“康复期”（长期连作，LTCC）：有害物质被清除，转而富集了抗生素、植物激素、营养信号分子等有益物质。

图a（根际土壤）：在长期连作（LTCC）的土壤里，抗生素、单萜（植物防御物质）、糖苷等有益化学物质的含量大幅上升（红点主要在右侧）。图b（根内部）：在植物体内，与生长、免疫、信号传导相关的关键物质（如玉米素，一种植物激素）也发生了显著变化。

图c（土壤中的通路）：长期连作土壤中，群体感应、抗生素合成、生物膜形成等微生物通讯和防御相关的通路被强烈激活。同时，油菜素内酯、类胡萝卜素等植物激素和生长物质的合成通路也增强了。

图d（根内的通路）：植物体内，玉米素（促生长激素）合成、类黄酮（抗病物质）合成、淀粉与糖代谢等与生长、抗逆和能量供应相关的通路被显著影响

图e：发现“化学物质联盟”这张聚类树状图和模块颜色图是“网络关系图”，揭示哪些化学物质总是一起变化、协同工作。科学家发现，这些变化的化学物质不是孤立的，而是形成了几个功能协同的“联盟”。比如，一个“防御联盟”（可能包含多种抗生素和抗病物质），一个“生长调节联盟”（包含多种激素）

每一行：代表一种 “有益代谢物” （比如某种抗生素、植物激素或信号分子）。每一列：代表不同的连作年限（CC1到CC25）。颜色：从蓝色到红色，表示该物质的含量从低到高。关键看最右边一列（CC25）是不是一片“红”。图a（根际土壤）：在CC25的土壤里，一大串有益物质（如脂肽、吩嗪等抗生素，以及独脚金内酯等信号分子）的含量显著高于其他年限，尤其是病重的CC13。这说明康复期土壤成了一个“天然药房”，充满了抑菌和促生的化学物质。图b（根内部）：在CC25的大豆根内部，与生长调节（如赤霉素）、抗病反应（如水杨酸）和营养（如维生素） 相关的物质也特别丰富。这说明植物本身也更健康、防御更强。图c：验证“特效药”的战斗力，体外杀毒实验。科学家从清单里挑出一个“明星分子”——3-甲基硫丙醇，测试它是否能直接抑制大豆常见病害（根腐病）的病原菌。

（9）Soil chemical properties and allelopathy show contrasting patterns between STCC and LTCC土壤化学性质与化感作用在短期和长期连作中呈现相反模式

（10）Microbial Community Restructuring across CC Transitions连作转变过程中的微生物群落重组

（11）Non-linear succession of microbial functional potential微生物功能潜能的非线性演替

图a & 图b：查看“技能包”配置，每一行：代表一种 “有益技能”（即功能基因），比如固氮基因、解磷基因、铁载体合成基因（帮助植物获取铁元素）、抗盐/抗旱基因等。每一列：代表不同的连作年限。颜色：从蓝色到红色，表示携带这种“技能”的基因在群落中的相对丰度从低到高。图c & 图d：统计“部门效能”这两张统计图是 “部门绩效考评”，从更宏观的“代谢通路”层面，验证了功能基因的变化如何影响整体功能。每个点：代表一条完整的 KEGG代谢通路（可以理解为一个“功能部门”，比如“氮代谢部”、“磷酸盐转运部”）。点的位置：横坐标是连作年限，纵坐标是该通路相关基因的相对丰度

（12）Compartment-specific microbial-metabolite interactions分区特异性微生物-代谢物相互作用

图a：环境、菌群与化学信号的“三角关系”三个圆圈：分别代表 “土壤理化性质”、“根际微生物群落” 和 “关键有益代谢物”。连线与数值：两个圆圈之间的连线，以及上面的数字（如r=0.832）和星号（），代表它们之间的相关性强度和显著性。数字越大（越接近1）、星号越多（），表示两者关系越紧密、越不是偶然。最强驱动关系：“微生物群落” 与 “有益代谢物” 之间的连线最粗，相关性系数最高（r=0.832），且显著性最强（*）。这证明：微生物群落结构的变化，直接、强有力地决定了根际化学物质（代谢物）组成的变化。图b & 图c：揭示了那些在“病重期”（STCC）消失的有益菌，和康复期（LTCC）出现的有益化学物质之间，存在千丝万缕的潜在联系。橙色方块：代表在长期连作（LTCC）土壤或根内富集的有益代谢物（就是图4里的“特效药”清单，比如3-甲基硫丙醇、脂肽等）。蓝色圆圈：代表在短期连作（STCC）中耗竭的有益微生物菌株（就是研究一开始发现“没了”的那些好细菌，比如假单胞菌、伯克氏菌等）。图b（土壤中的网络）：在土壤里，多种有益代谢物（橙色方块）与多种缺失的菌株（蓝色圆圈）紧密相连。这说明，这些在STCC消失的“特种兵”菌株，很可能正是生产或维持这些“特效药”（有益代谢物）的关键生产者。图c（根内的网络）：在植物根内部，也形成了类似的紧密网络。这进一步说明，植物内部健康化学环境的营造，同样依赖于那些在STCC中缺失的根内有益菌。

（13）Microbial Consortium Construction and Disease Suppression微生物群落构建与病害抑制

图a：划定“海选范围”，通过复杂的网络分析，从成千上万的微生物中，圈定了最值得关注的候选者。三个圆圈代表从不同分析角度（如相关性、重要性等）筛选出的前50个重要的细菌属。它们重叠的部分，就是 “三科状元”——从多个维度看都至关重要的核心属。图b & 图c：第一轮“能力测试”这部分是基础体能考核，测试候选菌株的基本实力。图b（可培养细菌丰度）：比较不同连作年限土壤中，这些“明星家族”里能被实验室培养出来的细菌数量。这证实了在CC25（康复期）土壤中，这些好细菌确实更多、更容易获取。图c（促生长效果评估）：这是硬指标测试。将从CC25土壤中分离出的10株候选细菌，单独接种给大豆幼苗。柱状图显示，这10株菌都能显著增加大豆的鲜重（FW），证明它们个个都是能促进植物生长的“实力派”。图d & 图e：图d（促生长特性）：检测每株菌的具体“技能”，比如产植物激素（IAA）、溶解磷酸盐、产铁载体、固氮等。这就像检查应聘者有没有“营养师证”、“肥料师证”。图e（菌株间互作）：这是团队兼容性测试，至关重要！图展示了任何两株菌之间的相互作用。圆圈越大，表示一株菌的培养上清液（含有其分泌的代谢物）对另一株菌的生长促进效果越强。这表明它们在一起能“和睦相处”，甚至互相喂饭，协同增效。图f（核心菌鉴定）：综合前面的所有测试数据（网络重要性、促生效果、技能、互作），通过多指标分析，最终圈定了7个核心菌株。它们就是未来合成菌群 SC7的7名正式队员。图g（定殖能力验证）：让这10株候选菌（包括最终入选的7株）单独去感染大豆根，用荧光标记看它们能否成功 “驻扎”在根部（绿色荧光）。

图a：微生物肥料的“促生长效果”这张图展示了合成微生物肥料（即用筛选出的菌株制成的肥料）对大豆生长的直接影响。对比不同处理下大豆的株高和鲜重。关键比较 “SC7”（接种了7株合成菌群） 与 “CK”（不接菌的空白对照） 以及 “CC25”（接种来自CC25土壤的天然混合菌群） 的差异。人工团队不输天然团队：接种 SC7 的大豆，其生长指标与接种 CC25 天然菌群的效果没有显著差异，且都显著优于空白对照。图b：微生物肥料的“固氮工厂建设效果”这张图聚焦于一个对豆科作物至关重要的指标——根瘤（大豆的天然氮肥工厂）。SC7显著促进结瘤：接种 SC7 的处理，其根瘤数量显著高于空白对照（CK），也高于仅接种病原菌的对照（CKP）。核心功能体现：根瘤的形成需要根际微生物提供特定的信号和环境。SC7能显著增加根瘤，说明它成功重塑了健康的根际环境，激活了大豆的固氮能力，这是增产的关键基础之一。图c：菌群与土壤提取物的“防病效果PK”横坐标：不同处理，包括：空白（CK）、只接病原菌（CKP，病害最重）、化学农药（FM）、接种不同合成菌群（SC7等）、以及施用不同年限连作土壤的提取液。SC7效果卓越：接种 SC7 的防病效果（约70%）显著优于其他合成菌群（如SC2），并且与化学农药（FM）的效果相当，无显著差异。

Continuous cropping obstacles (CCO) pose a persistent threat to global soybean sustainability, yet paradoxically attenuate under prolonged monoculture. To explore this, we investigated the soil–plant-microbiome dynamics across 1-year, short-term continuous cropping (STCC, 7–13 years), and long-term continuous cropping (LTCC, 19–25 years) systems.