根际相关微生物群在植物对病害胁迫的响应中起着至关重要的作用。植物次生代谢物被认为是根际微生物群落组装的关键调节因子，特别是在促进有益微生物定殖方面。尽管这一重要性已被认识到，但对于这种代谢组驱动的微生物组组装如何具体决定植物对土传病害的抗性，仍缺乏更深入的理解。

Metabolome-driven rhizosphere microbiome assembly determining the health of medicinal herb (Angelica sinensis) against root rot

Background

（1）The rhizosphere-associated microbiota plays a crucial role in plant responses to disease stress. Plant secondary metabolites are recognized as crucial mediators in the assembly of rhizosphere microbial communities, particularly by enhancing the colonization of beneficial microorganisms. Despite this recognized importance, a deeper understanding of how such metabolome-driven microbiome assembly specifically determines plant resistance against soil-borne diseases is still lacking. 根际相关微生物群在植物对病害胁迫的响应中起着至关重要的作用。植物次生代谢物被认为是根际微生物群落组装的关键调节因子，特别是在促进有益微生物定殖方面。尽管这一重要性已被认识到，但对于这种代谢组驱动的微生物组组装如何具体决定植物对土传病害的抗性，仍缺乏更深入的理解。

（2）Here, we focused on the widely planted medicinal plant Angelica sinensis and demonstrated that root rot-diseased rhizosphere soils (DRS) exhibited a higher relative abundance of Fusarium and a lower relative abundance of Streptomyces compared to healthy rhizosphere soils (HRS). 在本研究中，我们以广泛种植的药用植物当归为对象，研究结果表明，与健康根际土壤相比，根腐病发病根际土壤中镰刀菌属的相对丰度较高，而链霉菌属的相对丰度较低。

（3）Shotgun metagenomic sequencing revealed that metabolism-associated genes, particularly those related to steroid degradation, are significantly enriched in HRS samples. 鸟枪法宏基因组测序揭示，代谢相关基因，特别是与类固醇降解相关的基因，在健康根际土壤样本中显著富集。

（4）Subsequent genome and functional gene analysis of Streptomyces revealed that the steroid degradation-related genes are associated with rhizosphere colonization in hosts. 随后对链霉菌的基因组和功能基因分析表明，类固醇降解相关基因与宿主根际定殖能力相关。

（5）Rhizosphere Streptomyces S15 directly antagonized Fusarium and enhanced the root resistance of A. sinensis. 根际链霉菌S15能直接拮抗镰刀菌，并增强当归的根系抗性。

（6）Comparative metabolomics showed that A. sinensis plants from HRS secreted more lipid and lipid-like molecules than those from DRS, especially sterol lipids and long-chain fatty acids, which promoted the growth of Streptomyces S15 isolates. 比较代谢组学分析显示，来自健康根际土壤的当归植株比来自发病根际土壤的植株分泌了更多的脂质和类脂分子，尤其是甾醇脂质和长链脂肪酸，这些物质促进了链霉菌S15分离株的生长。

（7）Transcriptome analysis validated that the lipid hormones are essential for sporulation, biofilm formation, and streptomycin biosynthesis of S15 strain. Finally, exogenous application of synbiotics (lipid prebiotics and S15) to A. sinensis resulted in the enrichment of S15-homologous Streptomyces amplicon sequence variant (ASV), further establishing beneficial bacterial communities in Fusarium-stressed rhizospheres. 转录组分析证实，脂质激素对S15菌株的孢子形成、生物膜形成和链霉素生物合成至关重要。最后，向当归外源施用合生制剂后，S15同源链霉菌ASV得到富集，从而在镰刀菌胁迫的根际中进一步建立了有益细菌群落。

（8）Our study proposes that A. sinensis recruits steroid-metabolizing Streptomyces species by exuding key lipid compounds (i.e., methyl jasmonate and brassinolide) to combat Fusarium root rot. This study provides novel insights into using functional synbiotics as a promising strategy for manipulating plant-microbiome interactions to promote sustainable agriculture. 我们的研究提出，当归通过分泌关键的脂质化合物来招募能够代谢类固醇的链霉菌物种，以对抗镰刀菌根腐病。本研究为使用功能性合生制剂作为调控植物-微生物组互作以促进可持续农业的一种有前景的策略提供了新的见解。

（9）Result

（10） Root rot changes rhizosphere microbial composition and recruits distinct bacterial and fungal communities根腐病改变根际微生物组成并招募不同的细菌和真菌群落

健康当归的根际土壤里，有益菌“链霉菌”（Streptomyces）更多、有害菌“镰刀菌”（Fusarium）更少；生病植株则相反。

a – 田间症状对比 b – 根际菌群门水平组成。真菌：病株根际中 子囊菌门（Ascomycota，含镰刀菌） 占比上升。细菌：病株根际中 放线菌门（Actinobacteria，含链霉菌） 占比上升（但注意：放线菌门虽整体上升，其中关键的链霉菌属反而是下降的，这在图e中体现）。c – 菌群结构差异（PCoA）真菌群落：健康（HRS）与病株（DRS）之间没有显著分离（P=0.734）细菌群落：健康与病株之间显著分离（P=0.026）d – 核心菌属共有情况，真菌：62个属两者共有，细菌：77个属两者共有。e – 关键菌属丰度差异，红色 = 病株中增加，蓝色 = 病株中减少，Fusarium（镰刀菌）：病株中显著增加（红色），Streptomyces（链霉菌）：病株中显著减少（蓝色），其他如 Pir4 lineage 等也在病株中减少

（11） Lipid metabolism-related genes are enriched in HRS rhizosphere脂质代谢相关基因在健康根际土壤根际中富集

健康当归的根会分泌更多的脂类物质（尤其是茉莉酸甲酯和油菜素内酯），这些脂类物质能直接促进链霉菌生长，而链霉菌正好能抑制镰刀菌。

a – 健康土壤中富集的代谢通路。横坐标：统计显著性（P值）。纵坐标：KEGG代谢通路。红色点表示在健康土壤中显著富集。重点看 Steroid degradation（类固醇降解）、alpha-Linolenic acid metabolism（α-亚麻酸代谢） 等脂类代谢通路

b – 类固醇降解通路细节，红色标注的基因（choD、cyp、hsaD等）在健康土壤中富集，这些基因正是链霉菌降解固醇类物质所需的关键基因。

c – 代谢通路溯源到菌科，左图（HRS健康）：类固醇降解通路主要来自 Streptomycetaceae（链霉菌科），右图（DRS病株）：链霉菌科的贡献明显减少， 说明：健康土壤中，链霉菌是执行脂类降解的主力。

d – 代谢物整体差异（OPLS-DA），健康（HRS）和病株（DRS）的根际代谢物组成显著分离

e – 差异代谢物火山图，右上角区域：健康土壤中显著增加的代谢物，其中黄色高亮的是脂类物质 结论：健康土壤中有多种脂类代谢物显著增加

f – 健康土壤富集代谢物的分类饼图，脂类（Lipids）占比最大，具体包括：茉莉酸甲酯（MeJA）、油菜素内酯（BR）、PC(16:0/20:4)、2-甲氧基雌酮、大豆皂苷I、十一烷二羧酸。 结论：健康当归根际的“特殊信号/食物”主要是脂类

（12） Significantly greater abundance of lipid components in HRS健康根际土壤中脂质组分的丰度显著更高

（13） Streptomyces isolates are effective in inhibiting Fusarium oxysporum growth链霉菌分离株能有效抑制尖孢镰刀菌的生长

只有携带“类固醇降解基因”的链霉菌，才能利用茉莉酸甲酯（MeJA）和油菜素内酯（BR）生长；而这些链霉菌恰好能直接抑制镰刀菌。

a – 致病性验证，用分离出的 F. oxysporum 220 回接健康当归，结果：发病率接近 100%，说明：F. oxysporum 220 确实是导致根腐病的元凶

b – 病原菌形态，左上：PDA培养基上的菌落，右上：显微镜下的分生孢子形态，下排：接菌后植株叶片枯萎、根部腐烂（右边是对照健康植株）确认：这就是典型的镰刀菌根腐病

c – 三株链霉菌的系统发育树与对峙实验，从健康土壤中分离出多株链霉菌，选了其中3株拮抗能力强的：S1、S3、S15，对峙实验（右图）：中间是镰刀菌，四周接种链霉菌，结果：三株都能抑制镰刀菌生长（中间菌丝被“拦住”了），说明：链霉菌能直接拮抗病原菌

d – 类固醇降解基因检测，用简并引物检测三株链霉菌是否携带固醇降解相关基因（choD、cyp、hsaA、fadD）结果：S15：四个基因全有（有扩增条带）S1、S3：几乎都没有， 说明：只有 S15 这类链霉菌具备“吃固醇”的基因能力

e – 脂类物质对菌生长的促进作用，横坐标：CK（对照）、MeJA（茉莉酸甲酯）、BR（油菜素内酯），纵坐标：菌体生物量，结果：S15：加入 MeJA 或 BR 后，生物量显著增加，S1、S3：加入后几乎不增加，F. oxysporum（镰刀菌）：加入后也不增加说明：MeJA 和 BR 只能促进携带固醇降解基因的链霉菌（S15）生长，病原菌镰刀菌不能利用这些脂类物质。

（14） A. sinensis enriches rhizosphere Streptomyces with steroid degradation genes当归富集具有类固醇降解基因的根际链霉菌

（15） Lipid-derived plant hormone increased the transcription of essential genes in Streptomyces S15脂质来源的植物激素上调了链霉菌S15中关键基因的转录

脂类物质（MeJA和BR）不仅仅是“让链霉菌变多”，而是直接激活了链霉菌的一系列有益功能基因。

a – 转录组整体差异（PCoA）三个处理：CK（对照）、MeJA、BR三点明显分开，说明：加入脂类物质后，S15的基因表达发生了全局性改变

b – 差异基因富集的通路（气泡图），横坐标：富集程度，纵坐标：KEGG通路，被激活的通路包括：链霉素合成，生物膜形成，孢子形成，类固醇降解，脂肪酸代谢，说明：脂类物质同时激活了生长、防御、定植相关的多条通路。

c – 具体功能基因表达变化（热图），红色 = 基因表达上调，蓝色 = 下调，MeJA和BR处理后，以下基因显著上调：链霉素合成基因，生物膜形成相关基因，孢子形成相关基因，类固醇羟化酶基因，长链脂肪酸代谢基因， 说明：这些脂类物质是“多功能开关”，同时打开多项有益功能

d – S15能否利用脂类作为唯一碳源，用刃天青指示细菌生长（紫色→粉色 = 生长），加入MeJA或BR后，S15都能生长，S15确实可以把这些脂类物质“吃掉”作为能量来源

e – 脂类处理后发酵液的抑菌能力，用S15的发酵液去抑制镰刀菌，结果：经过MeJA或BR处理的S15，发酵液抑菌能力更强，说明：脂类物质诱导S15生产了更多抗生素类物质

f – 脂类对生物膜形成的影响，生物膜越多（OD₅₉₀越高）= 定植能力越强，结果：MeJA和BR都显著促进S15形成生物膜，脂类物质帮助S15更好地“扎根”在根表

g – 土壤中定植能力的验证，把S15、镰刀菌、脂类物质一起加入土壤，结果：加入MeJA或BR后，S15的数量显著增加，说明：在真实土壤环境中，脂类物质确实能帮助S15占优势

（16） Root rot disease performance and rhizosphere bacterial community responses triggered by synbiotics合生制剂引发的根腐病病害表现及根际细菌群落响应

把链霉菌S15和脂类物质（MeJA/BR）一起用（合生剂），比单独用其中任何一种都更有效，能显著减少镰刀菌数量、降低根腐病发病率，并且在田间也有效。

a – 实验设计与外观效果

六种处理：CK（对照，什么都不加），益生菌（仅S15），益生元（仅MeJA或仅BR），合生剂（S15 + MeJA 或 S15 + BR），照片直观显示：，合生剂处理组的当归根部明显更白、更完整CK和单独处理组的根部腐烂更严重。说明：合生剂在盆栽中效果最好

b – 镰刀菌基因拷贝数（定量PCR），纵坐标：F. oxysporum 基因拷贝数（越高 = 病原菌越多）结果：CK：最高，益生菌（S15）：有所下降，益生元（MeJA/BR）：略有下降，合生剂（S15+MeJA 或 S15+BR）：下降最明显， 说明：合生剂最能抑制病原菌。

c – 根腐病病情指数，纵坐标：病情指数（越高 = 病越重），结果与b图完全一致：，合生剂处理的病情指数最低。 说明：病原菌越少 → 病害越轻

d – 链霉菌S15的丰度，检测的是 ASV135（与S15 100%同源的序列），合生剂组中S15的丰度最高，单独加益生菌（仅S15）效果次之，单独加益生元（仅MeJA/BR）对S15丰度影响不大。说明：脂类物质帮助S15在根际大量繁殖

e – S15丰度与镰刀菌数量的关系，横坐标：S15丰度（ASV135），纵坐标：镰刀菌基因拷贝数，负相关：S15越多 → 镰刀菌越少，这是因果关系的直接证据

f – 田间验证（最关键的一张），在真实大田条件下重复实验，结果：合生剂处理组病情指数比对照组降低约24%。说明：这个方法不是只在实验室有效，在真正的农田里也有效

The rhizosphere-associated microbiota plays a crucial role in plant responses to disease stress. Plant secondary metabolites are recognized as crucial mediators in the assembly of rhizosphere microbial communities, particularly by enhancing the colonization of beneficial microorganisms. Despite this recognized importance, a deeper understanding of how such metabolome-driven microbiome assembly specifically determines plant resistance against soil-borne diseases is still lacking.