（1）Plants live in close association with microbial communities that support their health and growth. 植物与支撑其健康和生长的微生物群落紧密共生。

（2）Previous research has indicated that the composition of these communities can differ between genotypes of the same plant species. 已有研究表明，这些微生物群落的组成在同一植物物种的不同基因型之间可能存在差异。

（3）Host-related factors causing this variation are mostly unknown.导致这种变异的宿主相关因素大多未知。

Host metabolites explain microbiome variation between different rice genotypes 宿主代谢物解释不同水稻基因型间微生物组的差异

摘要

（1）Plants live in close association with microbial communities that support their health and growth. 植物与支撑其健康和生长的微生物群落紧密共生。

（2）Previous research has indicated that the composition of these communities can differ between genotypes of the same plant species. 已有研究表明，这些微生物群落的组成在同一植物物种的不同基因型之间可能存在差异。

（3）Host-related factors causing this variation are mostly unknown.导致这种变异的宿主相关因素大多未知。

（4）Microbiome genes, or M genes in short, are host genes that are involved in shaping the microbiome. 微生物组基因（简称M基因）是指参与塑造微生物组的宿主基因。

（5）We hypothesized that specific M genes are responsible for microbiome variation between rice genotypes and that it is connected to plant metabolites controlled by these genes.我们假设特定的M基因导致了水稻基因型之间的微生物组变异，并且这种变异与这些基因所控制的植物代谢物相关联。

（6）Our study was aimed at identifying plant metabolites driving genotype-specific microbiome assembly and establishing a link to host genetics. 我们的研究旨在识别驱动基因型特异性微生物组组装的植物代谢物，并建立其与宿主遗传学的联系

（7）Targeted metabolite quantification was combined with microbiome profiling of the rice phyllosphere microbiome, association analyses on single-nucleotide polymorphism (SNP) level, and genetic modifications to validate microbiome-shaping effects of the discovered M genes.我们将靶向代谢物定量与水稻叶际微生物组的微生物组分析、单核苷酸多态性水平的关联分析以及遗传修饰相结合，以验证所发现的M基因的微生物组塑造效应。

（8）Targeted metabolite quantifications revealed that phenylpropanoid concentrations in rice leaves can substantially differ among 110 representative genotypes grown under the same, controlled conditions.靶向代谢物定量分析显示，在相同受控条件下生长的110个代表性水稻基因型中，其叶片中的苯丙烷类化合物浓度存在显著差异。

（9）Redundancy analyses (RDA) showed that these metabolites can explain 35.6% of the variance in their microbiomes.冗余分析表明，这些代谢物可以解释其微生物组变异的35.6%。

（10） Further verification experiments resulted in the identification of two M genes.进一步的验证实验成功鉴定出两个M基因。

（11） OsC4H2 and OsPAL06 are both plant genes with microbiome-shaping effects, mainly via their role in ferulic acid biosynthesis.OsC4H2和OsPAL06都是具有微生物组塑造效应的植物基因，主要通过它们在阿魏酸生物合成中的作用来实现。

（12） Targeted gene mutation experiments confirm that distinct phyllosphere-associated bacterial groups are highly responsive to the discovered M genes.靶向基因突变实验证实，不同的叶际相关细菌类群对所发现的M基因高度响应。

（13） This study provides detailed insights into the links between host genetics and microbiome variation in plants.本研究为理解宿主遗传学与植物微生物组变异之间的联系提供了详细的见解。

（14） Knowledge about host genes that are in control of the microbiome paves the way for microbiome engineering and targeted plant breeding approaches.关于控制微生物组的宿主基因的知识，为微生物组工程和靶向植物育种方法铺平了道路。

（15） Result

（16） Phenylpropanoid concentrations in rice leaves differ between genotypes 水稻叶片中苯丙酸类化合物的浓度因基因型而异

110个水稻品种的叶面苯丙烷类代谢物谱，主要想说明两个问题：不同水稻亚种（籼稻和粳稻）在遗传上明显不同，它们的叶片代谢物（尤其是苯丙烷类）也存在显著差异

图 a：系统发育树 + 代谢物热图 这张图将110个水稻品种的遗传关系和代谢物水平直观地结合在了一起。内侧（系统发育树）：基于全基因组SNP差异构建。可以看出，110个品种明显分成了两大簇，一大簇是籼稻，另一大簇是粳稻，显示两者遗传背景差异很大。外侧（热图）：每根竖条代表一个水稻品种，颜色深浅代表其叶片中苯丙烷类物质的总浓度。可以看到，热图左侧（籼稻）和右侧（粳稻）的颜色模式明显不同。这表明，遗传差异大的水稻，其代谢物谱也不同。水稻的基因型差异，与苯丙烷类代谢物谱的差异是相关联的。它验证了“基因型影响代谢物”这一逻辑链条的前提。

图 b：基于代谢物的PCoA分析，这张图是对代谢物数据进行降维分析，将110个品种按照它们的代谢物组成相似度排列在二维平面上。青色点：籼稻，橙色点：粳稻。结果：代表两种亚种的点在图上明显分成了两群。

图 c–g：五种关键代谢物的浓度对比

这五张小提琴图/箱线图分别比较了5种具体的苯丙烷类代谢物及其前体在籼稻和粳稻中的浓度：

c. HCA（4-羟基肉桂酸）：一个中间产物。d. LPA（L-苯丙氨酸）：苯丙烷类代谢的起点原料。e. FLA（阿魏酸）：核心目标代谢物，后续实验证明它对微生物组影响很大。f. CFA（咖啡酸）g. SPLT（莨菪亭，一种香豆素）结果：在这5个图中，籼稻（青色）和粳稻（橙色）的浓度分布都呈现出非常显著的差异。结论：进一步具体化、定量化地证实了，不仅是总代谢物，这几种关键的苯丙烷类物质（特别是作为终产物的阿魏酸）在籼稻和粳稻中的含量就有本质不同。

（17） Microbial communities show substantial variation between rice genotypes 微生物群落在水稻基因型之间表现出很大的差异

110个水稻品种的叶际微生物组组成，目的是证明：不同基因型的水稻（籼稻 vs 粳稻），不仅代谢物不同，它们的叶际微生物群落结构和多样性也存在显著差异。

图 a：基于微生物组的PCoA分析。这张图与 Figure 1b 类似，但不是用代谢物数据，而是用叶际细菌群落组成数据进行降维分析。青色点：籼稻。橙色点：粳稻。结果：两种亚种的点在图上明显分离成两群。结论：籼稻和粳稻不仅代谢物不同，它们叶际“住着”的细菌群落结构也不同。

图 b：微生物组α多样性（Shannon指数）对比，这张箱线图比较了籼稻和粳稻叶际细菌群落的多样性。纵轴：Shannon指数（数值越高，多样性越高）结果：籼稻的微生物多样性显著高于粳稻。结论：不同水稻基因型不仅微生物“种类组成”不同，连“多样性水平”也有显著差异。籼稻叶际能容纳更多样化的细菌。

图 c：微生物群落的“目”水平组成（堆叠柱状图），这张图展示了每个水稻品种叶际细菌在“目”水平上的相对丰度（占比）。纵轴：相对丰度（%），横轴：110个水稻品种（每个品种有10个重复），颜色：不同颜色代表不同的细菌“目”。观察：虽然个体差异存在，但可以大致看出，某些细菌目（如Burkholderiales、Enterobacterales）在大多数品种中都是优势类群。结论：提供了叶际微生物组组成的全景图，为后续分析哪些具体菌在不同亚种间有差异提供了背景。

图 d：籼稻与粳稻间丰度差异最大的细菌属，这张图是图c的“差异放大镜”，专门筛选出在籼稻和粳稻之间丰度差异最显著的细菌属。横轴：差异倍数（log2FC），正值表示在籼稻中更丰富，负值表示在粳稻中更丰富。纵轴：细菌属名称，按所属“目”分类着色。圆圈大小：代表差异的显著性（越大越显著）。形状：方形代表在粳稻中更丰富，圆形代表在籼稻中更丰富。关键发现：有很多细菌属在籼稻和粳稻之间的丰度差异是指数级的（例如，Pantoea在籼稻中的丰度是粳稻的约8倍）。这些差异显著的细菌属于多个不同的“目”，说明亚种间的差异是广泛存在的，而非集中在某一类菌群。结论：具体找到了是哪些细菌导致了籼稻和粳稻叶际微生物组的整体差异。这些菌是后续研究“代谢物是否招募了特定细菌”的重点候选对象。

（18） Phenylpropanoids explain rice phyllosphere microbiome variation among genotypes 苯丙酸类化合物解释水稻叶际微生物组基因型间的变异

叶片中的苯丙烷类代谢物（尤其是阿魏酸）是驱动叶际微生物组组装的关键“信号”或“选择压力。

图 a：冗余分析（RDA）——代谢物与微生物组的整体关联，这是一种约束性排序分析，用于量化代谢物差异能在多大程度上解释微生物组差异。超过三分之一的叶际细菌群落结构差异，可以由叶片苯丙烷类代谢物的差异来解释。这是很强且显著的因果关系证据。

图 b–d：单个代谢物解释的微生物组变异，这三个图进一步分析了单个代谢物能解释多少微生物组变异含义：HCA和阿魏酸是解释微生物组变异的最主要代谢物。颜色梯度代表代谢物浓度，浓度越高，样本点在排序图上的分布越集中。

图 e：对代谢物最响应的10个细菌目，通过排列检验，筛选出受代谢物影响最显著的细菌目。结果：假单胞菌目是对代谢物变化响应最强烈的细菌目（差异倍数约2.5倍，P值最小）。这个结果将研究焦点从“整体微生物组”聚焦到了“假单胞菌目”上，暗示这类细菌可能特别“爱吃”或“爱响应”苯丙烷类代谢物。

图 f–h：假单胞菌目丰度与三种代谢物的相关性，这三张散点图直接验证了图e的推断，展示了假单胞菌目丰度与三种关键代谢物浓度的线性关系：代谢物浓度越高，假单胞菌目细菌的丰度也越高。这是一种剂量依赖的正相关关系，是因果关系的有力证据。

（19） Identification of phenylpropanoid biosynthesis pathway genes associated with metabolite-driven microbiome assembly 与代谢物驱动的微生物组组装相关的类苯丙酸生物合成途径基因的鉴定

它直接鉴定出了两个控制代谢物（阿魏酸）和微生物组（伯克霍尔德菌目）的宿主基因（M基因）。

第一部分：OsC4H2基因。

图 a：OsC4H2基因结构。展示了OsC4H2基因的外显子-内含子结构，以及在该基因上检测到的SNP位点（竖线）。说明这个基因在不同水稻品种中存在自然变异。

图 b：OsC4H2单倍型分析，根据基因上的SNP差异，将110个水稻品种划分为4种单倍型（HAP1、HAP2、HAP3、HAP4）。绿色标记表示不同单倍型之间的碱基差异。

图 c：不同单倍型的阿魏酸浓度，不同OsC4H2单倍型的水稻，其叶片阿魏酸浓度存在显著差异。OsC4H2的基因型变异，直接影响阿魏酸的合成。

图 d：不同单倍型的伯克霍尔德菌目丰度，不同OsC4H2单倍型的水稻，其叶际伯克霍尔德菌目的丰度也存在显著差异。OsC4H2的基因型变异，也直接影响特定细菌类群的丰度。 而且这个差异模式与图c中阿魏酸的差异模式高度一致（HAP1最高，HAP4最低）。

第二部分：OsPAL06基因。不同OsPAL06单倍型的水稻，其叶际伯克霍尔德菌目的丰度也存在显著差异，模式与阿魏酸一致（HAP1 > HAP2 > HAP3）。

（20） Validation of ferulic acid’s activity in shaping the phyllosphere microbiome

通过基因敲除和过表达实验，直接证明了：OsC4H2和OsPAL06这两个基因，确实控制着阿魏酸的合成，并进而塑造着叶际微生物群落。

图 a：微生物群落组成的目水平变化，这张堆叠柱状图展示了不同基因型水稻的叶际细菌目水平组成。改变这两个基因的表达，会直接导致伯克霍尔德菌目丰度的同向变化。这是基因控制微生物组的直接证据。

图 b：基于微生物组的PCoA分析，这张PCoA图从整体群落结构角度验证了基因改造的效果。五个基因型（WT、敲除、过表达）的微生物组在排序图上明显分离。敲除或过表达OsC4H2或OsPAL06，不仅改变了单个菌群（伯克霍尔德菌目）的丰度，而是显著地重塑了整个叶际微生物群落的结构。

图 c：伯克霍尔德菌目丰度的定量对比，这张柱状图定量地展示了不同基因型中伯克霍尔德菌目的丰度。两个基因的敲除和过表达，对伯克霍尔德菌目的丰度产生了相反且一致的效应。这提供了强有力的因果证据。

图 d：阿魏酸浓度的定量对比，张图展示了不同基因型中阿魏酸的浓度变化，模式与图c完全一致：基因敲除 → 阿魏酸下降 → 伯克霍尔德菌目丰度下降；基因过表达 → 阿魏酸上升 → 伯克霍尔德菌目丰度上升。这证明了阿魏酸是连接基因型和微生物组的关键中间分子。

图 e：机制示意图

这是一张总结性的机制模型图，用可视化方式概括了整篇论文的核心发现：粳稻 OsC4H2/OsPAL06的某种单倍型，阿魏酸等苯丙烷类代谢物浓度高，伯克霍尔德菌目等丰度高；籼稻 OsC4H2/OsPAL06的另一种单倍型，苯丙烷类代谢物浓度低，特定细菌类群丰度低，水稻通过M基因（OsC4H2/OsPAL06）控制阿魏酸的合成，而阿魏酸作为一种化学信号或碳源，选择性地富集了伯克霍尔德菌目等特定细菌，最终塑造了籼稻和粳稻之间不同的叶际微生物组。

用可视化方式概括了整篇论文的核心发现：粳稻 OsC4H2/OsPAL06的某种单倍型，阿魏酸等苯丙烷类代谢物浓度高，伯克霍尔德菌目等丰度高；籼稻 OsC4H2/OsPAL06的另一种单倍型，苯丙烷类代谢物浓度低，特定细菌类群丰度低，水稻通过M基因（OsC4H2/OsPAL06）控制阿魏酸的合成，而阿魏酸作为一种化学信号或碳源，选择性地富集了伯克霍尔德菌目等特定细菌，最终塑造了籼稻和粳稻之间不同的叶际微生物组。