（1） 一种濒危植物（青岛百合）如何通过与一种特定根际真菌的相互作用来促进自身生长（2）分离到一株名为长枝木霉QDAU 0920的真菌。它能成功在百合根部“安家”（定殖），并显著促进根系生长。（3）真菌通过影响植物体内的多种激素来促进生长，其中生长素的作用最关键。研究深入到蛋白质水平。（4）发现青岛百合体内一个名为LtIAA16的非典型蛋白，能够通过“竞争”方式，解除对其他蛋白（LtIAA6, 17, 11）的抑制，从而激活一个关键的生长调控因子LtARF22，最终促进根的生长。

摘要

（1）Habitat fragmentation and degradation have led to the critical endangerment of numerous wild plant species. Although significant achievements in the conservation of endangered wild plants in various regions worldwide, the interaction mechanisms between these plants and their associated rhizosphere microorganisms have yet to be fully elucidated. 栖息地的破碎和退化已经导致许多野生植物物种濒临灭绝。尽管世界各地在保护濒危野生植物方面取得了显著的成就，但这些植物与其相关根际微生物之间的相互作用机制尚未完全阐明。

（2）Here, we present a communication model between the endangered wild plant Qingdao lily (Lilium tsingtauense) and its associated rhizosphere microorganisms. 在这里，我们提出了一个濒危野生植物青岛百合(Lilium tsingtauense)及其相关根际微生物之间的沟通模式。 

（3）We isolated a rhizosphere fungus, Trichoderma longibrachiatum QDAU 0920, which effectively colonizes the roots of Qingdao lily and significantly promotes root growth 我们分离到一株根际真菌，长枝木霉QDAU 0920，它能有效地在青岛百合根部定殖并显著促进根部生长 .

（4）This growth enhancement is mediated by multiple plant hormones, with auxin playing a particularly prominent role 这种生长增强是由多种植物激素介导的，其中生长素起着特别突出的作用 .

（5）Further investigation revealed that a non-canonical AUX/IAA protein of the LtIAA16 may augment the transcriptional activation activity of LtARF22 by competitively interacting with LtIAA6, LtIAA17, and LtIAA11, thereby facilitating root growth in Qingdao lily. 进一步的研究表明，LtIAA16的非规范AUX/IAA蛋白可能通过与LtIAA6、LtIAA17和LtIAA11的竞争性相互作用增强LtARF22的转录激活活性，从而促进青岛百合的根生长。 

（6）The growth-promoting effects of this interaction were subsequently validated in several other plant species, including tomato, pepper, corn, pumpkin, and cucumber. 这种相互作用的生长促进效应随后在其他几个植物物种中得到验证，包括番茄、辣椒、玉米、南瓜和黄瓜。 

（7）Notably, T. longibrachiatum QDAU 0920 forms synthetic microbial consortia (SynComs) in conjunction with other Trichoderma and Penicillium species. These SynComs consistently enhance the growth of Qingdao lily as well as other lily species such as L. lancifolium, Lilium 'Avalon Sunset', and Lilium 'Deliana'. 值得注意的是，T. longibrachiatum QDAU 0920与其他木霉属和青霉属物种一起形成合成的微生物聚生体(SynComs)。这些SynComs持续促进青岛百合以及其他百合品种的生长。

（8）Collectively, these findings underscore the considerable potential of native microorganisms in the development of plant growth-promoting agents and the conservation of endangered plant species. 总之，这些发现强调了天然微生物在开发植物生长促进剂和保护濒危植物物种方面的巨大潜力。

（9） Result

（10）Root microbiome is conducive for Qingdao lily growth根际微生物组有利于青岛百合的生长

a. 青岛百合的分布与丰度图 b (崂山), c (大泽山), d (招虎山): 分别展示了这三个不同山脉中，青岛百合种群在不同海拔梯度上的分布比例。e. 土壤样本采集点示意图f, g, h. 不同海拔百合的生长指标，内容： 柱状图对比了在LA (低海拔)、MA (中海拔)、HA (高海拔) 土壤中生长的青岛百合的：i, j, k. 灭菌土壤验证实验。i (实验示意图): 说明了实验设计：将百合幼苗分别种植在灭菌和未灭菌的根际土壤中。j (幼苗生长状态对比图): 左右两张照片直观显示，生长在未灭菌土壤（右）中的百合幼苗，其生长状态（如大小、茂盛程度）远好于灭菌土壤（左）中的幼苗。k (生物量柱状图): 定量数据证实，在未灭菌土壤中生长的百合，其鲜重和干重都显著更高。

（12）Rhizosphere fungi is an important factor for Qingdao lily growth and distribution根际真菌是影响青岛百合生长和分布的重要因素

青岛百合根际微生物群落与其生长之间的具体关系。

a (细菌): 堆叠柱状图展示了在低、中、高海拔土壤中，根际细菌群落在门分类水平上的相对丰度。不同颜色代表不同的细菌门（如变形菌门、放线菌门等）。b (真菌): 与a图类似，展示了真菌群落在门水平上的组成。c, d, e. 微生物α多样性沿海拔梯度的变化 f. 相关性网络分析图 g, h. 关键真菌属的分析。g (韦恩图): 展示了在低、中、高三个海拔的根际土壤中，真菌属水平上的物种共享情况。重叠部分表示共有属，不重叠部分表示海拔特有属。这有助于识别核心微生物组（所有海拔都有）和海拔特异性微生物。h (丰度最高的7个真菌属): 柱状图列出了在所有样本中平均相对丰度最高的7个真菌属，并比较了它们在不同海拔的丰度差异。

（13）T. longibrachiatum QDAU 0920 is a potential plant growth-promoting fungi长枝木霉QDAU 0920是一种潜在的植物促生真菌

从青岛百合根际微生物群落中，分离、鉴定出具有促生功能的真菌，并验证其效果。

a. 真菌分离株的系统发育树及菌落形态。左图（系统发育树）： 展示了所有分离得到的真菌在进化上的亲缘关系。T. atroviride 和 T. paratroviride（红色字体标出）被选为外群，用于确定进化树的根部和方向。b. 分离真菌属在根际土与本体土中的相对丰度。c. 群落特征与分离真菌属的相关性网络 d, e, f, g, h. 促生功能验证实验（以拟南芥为模型）。

（4）QDAU 0920 colonize the roots and promote Qingdao lily growth QDAU 0920定殖于根部并促进青岛百合生长

在模式植物验证的基础上，深入、全面地验证长枝木霉QDAU 0920对青岛百合（本研究的核心目标植物）的促生效果，并从组织细胞层面揭示其作用。

a (表型图): 直观对比了青岛百合幼苗在接种QDAU 0920后0天和14天的生长情况。c (生物量), d (主根长度): b. 根部定殖检测（台盼蓝染色）内容： 使用台盼蓝（一种可以染死细胞/真菌结构的染料）对根部进行染色。图中应能清晰地看到真菌的菌丝紧密缠绕或附着在百合根系的表面（甚至可能侵入皮层）。e, f, g, h, j, k. 细胞及亚细胞结构影响（扫描电镜与测量）e (扫描电镜图): 提供了根和鳞茎（储存养分的球状茎）表面的超高分辨率微观形貌。f (细胞周长), g (平均细胞面积): 测量显示，接种真菌后，根和鳞茎的细胞尺寸显著增大。h, k (细胞壁厚度变化): 通过电镜图和定量测量，发现接种后根细胞的细胞壁明显增厚。j (细胞长宽比), i (细胞密度): 可能显示细胞形状和排列方式发生变化。

l, m, n. 长期促生效果与鳞茎发育。

（15）QDAU 0920 colonization influenced hormone-responded genes in the roots of Qingdao lily QDAU 0920的定殖影响了青岛百合根部激素响应基因的表达

从基因表达层面（转录组学）揭示长枝木霉QDAU 0920促进青岛百合生长的分子机制，并聚焦于植物激素信号通路的关键作用。以下是各子图的详细解释：a. 主成分分析，对照组： 未接种，第0天取样（生长基线）。模拟组： 未接种，第14天取样（自然生长对照）。处理组： 接种真菌，第14天取样（实验处理）。b. 差异表达基因韦恩图，c (KEGG富集分析): 对通过WGCNA分析鉴定出的几个关键基因模块（棕色、粉色、红色、绿色、青绿色）进行功能富集，看它们主要参与哪些代谢或信号通路。d (WGCNA热图): 展示了不同基因模块与植物关键生长表型（鳞茎重、总重、根长、细胞面积、细胞周长、细胞壁厚度）之间的相关系数。颜色越深（红/蓝），表示正/负相关性越强。目的： WGCNA是一种高级分析方法，能将数千个基因根据表达模式聚类成若干个“模块”。图d揭示了哪些基因模块与图4中观测到的特定促生表型（如细胞增大、根伸长）强相关。图c则进一步告诉我们这些关键模块可能参与哪些生物学过程。这极大地缩小了研究范围。e, f, g, h-n. 植物激素的全面分析，e (激素物质测定): 柱状图直接测量了三种处理下，植物体内多种激素或其前体/代谢物的含量。f (激素信号转导DEGs比例): 饼图显示了在所有DEGs中，参与七大激素信号通路的基因所占的比例，突出哪些激素通路被广泛调控。g (生长素合成与信号转导基因热图): 重点关注生长素，展示参与其合成和信号转导的关键基因在处理组中的表达变化。这些基因很可能被显著上调。h-n (多种激素含量变化): 一系列柱状图定量比较了接种与未接种条件下，IAA、ABA、GA3、JA、SA、ACC、tZ 这七种重要激素的具体含量变化。

（16）LtIAA16 interacted with proteins of LtIAAs and LtARF22 LtIAA16蛋白与LtIAAs和LtARF22蛋白发生相互作用

在确定生长素（IAA）是关键信号后，深入研究其信号通路中关键蛋白（LtIAA16）的具体作用机制，特别是它与相关蛋白的相互作用。

a. 生长素信号基因与转录因子的共表达网络。内容： 使用WGCNA方法，构建了一个包含生长素信号通路关键基因（LtLAX, LtIAA, LtTIR, LtSAUR, LtGH3, LtARF）和 126个转录因子 的共表达网络。 从全局角度，筛选出与生长素信号协同变化、且可能调控下游生长表型（如根长、细胞大小）的关键转录因子。b. 高相关性基因筛选,内容： 从网络a中，进一步筛选出相关性系数 > 0.8 的基因对。橙色连线表示正相关，蓝色表示负相关,目的： 将范围缩小到表达模式高度同步的核心基因群，这些基因最有可能在同一个功能模块中协同工作。c. 关键转录因子的韦恩图,内容： 展示了通过WGCNA分析筛选出的关键转录因子与已知的生长素信号通路基因之间的重叠情况。 d. 关键基因表达验证（RT-qPCR）内容： 通过实时定量PCR，验证了真菌QDAU 0920接种后，7个关键基因在青岛百合根中的动态表达变化。e. 酵母双杂交验证蛋白互作,内容： 使用经典的酵母双杂交系统，以 LtIAA16 为“诱饵”，验证它与 LtIAA6, LtIAA17, LtIAA11, LtARF22 的相互作用。关键发现： 只有同时含有LtIAA16（AD融合）和候选蛋白（BD融合）的酵母菌，才能在四缺培养基（-Trp/-Leu/-His/-Ade）上生长，这直接证明了 LtIAA16 能与这4个蛋白发生特异性相互作用。f. 荧光素酶互补成像验证蛋白互作,内容： 在活体植物（烟草叶片） 中验证互作。将 LtIAA16 与荧光素酶N端融合，其他蛋白与C端融合。只有互作的蛋白才能将荧光素酶重构，产生发光信号。g. Pull-down 实验验证蛋白互作.内容： 体外生化实验验证。将 LtIAA16 带上His标签，其他4个蛋白带上GST标签。用谷胱甘肽珠子抓取GST融合蛋白，看是否能“下拉”His-LtIAA16。h. 蛋白互作结构预测,内容： 利用AlphaFold 3人工智能模型，预测了 LtIAA16 分别与 LtIAA6、LtIAA17、LtIAA11、LtARF22 形成的蛋白质复合物的三维结构。

（17）LtIAA16 mediated auxin accumulation and enhance QDAU 0920 colonization LtIAA16介导生长素积累并增强QDAU 0920的定殖

通过遗传学和药理学手段，在植物和真菌两个层面双向验证“LtIAA16-生长素（IAA）-真菌定殖”三者之间的正向调控环路。

a-d. 遗传学验证：LtIAA16是促生和增效的关键。a (表型图): 直观对比了过表达 LtIAA16 和 沉默 LtIAA16 的青岛百合在五周后的鳞茎和根系形态。过表达植株明显更大，根系更发达。b (表达量): 定量验证了遗传操作的有效性：OE-LtIAA16 中基因表达大幅升高，TRV-LtIAA16 中则被有效沉默。c (鲜重), d (主根长): 量化了遗传操作及真菌接种对生长的影响。e-f. 遗传学验证：LtIAA16正调控真菌定殖e (定殖率柱状图): 定量比较了三种基因型植株根部的真菌定殖率。f (台盼蓝染色与PCR电泳): 通过染色直观展示根内菌丝，并通过真菌特异性PCR（607bp条带）从分子水平检测定殖。g, k-l. 药理学验证：生长素（IAA）直接调控真菌定殖。g (染色与PCR电泳): 用不同浓度的外源IAA（生长素）和NPA（生长素运输抑制剂）处理百合根，然后接种真菌，检测定殖情况。k (实验示意图): 展示了“根分叉”实验的设计，可能用于局部施加激素。l (定殖率柱状图): 定量显示了不同浓度IAA和NPA处理下的真菌定殖率。

h-j. 真菌层面验证：生长素直接促进真菌生长，内容： 在不含植物的培养基中，直接研究IAA对真菌 QDAU 0920 的影响。h (菌落形态): 观察菌落大小和形态。关键发现（核心结论4）： 在培养基中添加IAA，能直接促进 QDAU 0920 真菌本身的生长（OD600和菌落面积均增加）。这证明IAA不仅是植物的信号分子，也直接作为一种营养物质或信号刺激真菌生长。

（18）The distribution of Qingdao lily may have experienced the selection of specific soil microbial community青岛百合的分布可能经历了特定土壤微生物群落的选择

a-b. 关键真菌的海拔分布与根际富集 a (本体土DNA拷贝数): 显示 QDAU 0920 在本体土壤中的数量沿海拔梯度（LA, MA, HA）的变化。b (根际土DNA拷贝数): 显示 QDAU 0920 在根际土壤中的数量沿海拔梯度的变化。目的： 将核心功能菌（QDAU 0920）的分布与图1中观察到的“百合在高海拔生长更好” 的现象直接关联起来，提供了直接的微生物地理学证据。

c (相关性网络): 展示了在不同海拔的根际和本体土中，木霉属与其他真菌属（丰度>1%）的相关性。连线表示正相关（红色）或负相关（蓝色）。d (丰度分布柱状图): 展示了三个关键有益真菌属 木霉属、Leohumicola属、青霉属 在不同海拔根际土中的相对丰度。协同共生网络： 网络图显示，木霉属、Leohumicola属、青霉属 三者之间呈显著正相关。这意味着它们在土壤中倾向于“结伴出现”，形成一个天然的共生微生物联盟。协同海拔响应： 柱状图d证实，这个“联盟”的成员（木霉、Leohumicola、青霉）的丰度都一致地随海拔升高而增加。e-g. 土壤代谢物：连接植物与微生物的化学语言，e (相关性热图): 展示了根际土壤中多种代谢物与上述三个关键真菌属丰度之间的相关性。f, g (特定代谢物柱状图): 重点展示了两种代谢物 D-glycero-beta-D-manno-Heptose 1,7-bisphosphate (β-HBP) 和 3-磺基丙氨酸 在不同海拔的浓度，它们与关键真菌属正相关。 提出一个核心假设——土壤中的特定代谢物（可能是植物或微生物分泌的）塑造了特定的微生物群落。高海拔土壤中这些代谢物的积累，可能“选择”或“滋养”了木霉等有益真菌群。h. 分子机制验证：真菌诱导植物合成关键代谢物。内容： 通过RNA-seq数据，展示了接种 QDAU 0920 后，青岛百合根中3-磺基丙氨酸生物合成通路相关基因（LtATCYSC, LtcysK, LtCTH）的表达量变化。关键发现： 接种真菌后，这些合成基因显著上调。目的（揭示完整循环）： 这提供了机制的闭环证据。它表明：真菌定殖（QDAU 0920）→ 2. 诱导植物根系合成特定代谢物（3-磺基丙氨酸）→ 3. 代谢物分泌到根际 → 4. 促进有益微生物群（木霉联盟）的富集 → 5. 微生物群促进植物生长 → 6. 植物生长更好又可能分泌更多代谢物

（19）Sycncoms microbial fertilizer steadily promoted the growth of Qingdao lily in the field合成微生物菌肥（Syncoms）在田间稳定地促进了青岛百合的生长

将从青岛百合根际中分离、鉴定和验证过的核心益生真菌，构建成稳定的合成微生物菌剂，并测试其在真实田间环境下的生存能力和促生效果。

a-c. 菌剂候选菌株的分离与鉴定。a (研究模型示意图): 概括了从根际土壤分离、纯化到培养测试的全流程。b (系统发育树): 展示了新分离的候选菌株（QNYL14-17）以及其他已鉴定菌株（包括核心菌 QDAU 0920）在进化上的亲缘关系。c (菌落形态): 展示了QNYL14-17这四个候选菌株的菌落外观。目的： 确立菌剂开发的菌种库。基于之前的研究（图8），选择了与核心菌 QDAU 0920 可能存在协同作用的土著真菌（可能属于青霉属等），并明确了它们的身份和纯度。d. 菌株间相容性测试，内容： 将 QDAU 0920 分别与四个候选菌株（QNYL14-17）进行共培养，比较它们与单独培养时的菌落面积比率。关键发现： 柱状图显示，共培养后，QDAU 0920 的菌落面积与单独培养相比没有显著差异，而其他四个菌株的菌落面积在共培养时有所减小。f-g. 菌剂配方与菌株存活率测试f (田间实验设计模型): 示意图说明了田间实验的设置：天然微生物群落 作为对照，合成的SynComs菌剂 作为处理组。g (载体中菌株存活曲线): 测试了各菌株在菌剂载体（黄腐酸、磷酸二氢钾、土壤活化剂、水）中，在35天内的存活数量（CFU/mL）。e. 田间定殖追踪，关键发现： 在整个接种期间（0-35天），所有5个菌株的ITS信号都持续存在，且相对丰度逐渐增加。h. 田间试验表型图。内容： 展示了在田间条件下，施用SynComs复合菌剂（处理组）与施用普通肥料（对照组）后，青岛百合和卷丹百合在不同时间点的地上与地下部分整体形态对比照片。i-o. 田间生长指标的定量分析

Habitat fragmentation and degradation have led to the critical endangerment of numerous wild plant species. Although significant achievements in the conservation of endangered wild plants in various regions worldwide, the interaction mechanisms between these plants and their associated rhizosphere microorganisms have yet to be fully elucidated. 栖息地的破碎和退化已经导致许多野生植物物种濒临灭绝。尽管世界各地在保护濒危野生植物方面取得了显著的成就，但这些植物与其相关根际微生物之间的相互作用机制尚未完全阐明。