（1）内生细菌生活在植物组织内部，其微环境可能缺氧，但这种缺氧的程度及其对细菌功能的影响尚不清楚。a. 植物根内确实缺氧：使用微传感器测量甜菜幼苗根部，发现从表皮到内皮层再到维管组织，氧气水平急剧下降至可变且较低的水平。

（2）细菌对低氧的响应（以 Flavobacterium sp. 98 为例）：实验条件： 在100 ppm的低氧环境下进行研究。表型变化：生长减缓。运动性增强。菌落形态扩散。代谢变化（胞外代谢物谱改变）：积累增加： 溶血磷脂酰乙醇胺和N-乙酰苯丙氨酸。积累减少： 抗真菌化合物5,6-二甲基苯并咪唑。功能变化：与在常氧条件下生长的细菌相比，低氧条件下生长的菌株能更有效地抑制甜菜根部病原菌Rhizoctonia solani的菌丝生长。

摘要

（1）Oxygen plays a crucial role in shaping microbial physiology, functions, and behavior 氧气在塑造微生物的生理、功能和行为方面起着至关重要的作用 .

（2）Endophytic bacteria, residing within plant tissues, inhabit microenvironments where oxygen availability can be limited. 内生细菌存在于植物组织中，栖息在氧气有限的微环境中。 

（3）However, the magnitude of hypoxic conditions in the endosphere and how these affect functional microbial traits are largely unknown. 然而，内球层中缺氧条件的程度以及这些如何影响功能性微生物特征在很大程度上是未知的。  

（4）Here, we showed with a microsensor that oxygen levels in roots of sugar beet seedlings drop drastically to variable, low oxygen levels when going from epidermal to endodermal root tissue into the vasculature. 在这里，我们用微型传感器显示，当从表皮到内胚层根组织进入脉管系统时，甜菜幼苗根部的氧气水平急剧下降到可变的低氧水平。

（5）Subsequently, we investigated phenotypic and metabolic responses of endophytic Flavobacterium sp. 98 at oxygen levels of 100 ppm. 随后，我们研究了内生黄杆菌的表型和代谢反应。氧气含量为100 ppm时为98。 

（6）Under these low oxygen conditions, Flavobacterium sp. 98 showed reduced growth, enhanced motility, and an altered extracellular metabolite profile. 在这些低氧条件下，黄杆菌属。98表现出生长减缓、运动性增强和细胞外代谢谱改变。

（7）Flavobacterium sp. 98 colonies spread out in response to oxygen limitation and more effectively restricted hyphal growth of the sugar beet root pathogen Rhizoctonia solani than Flavobacterium sp. 98 grown at ambient oxygen conditions 黄杆菌属。98个菌落响应于氧限制而展开，并且比黄杆菌属更有效地抑制了甜菜块根病原体立枯丝核菌的菌丝生长。98在环境氧气条件下生长 .

（8）Exometabolome analysis revealed enhanced accumulation of lysophosphatidylethanolamine (lysoPE) and N-acetyl-phenylalanine under low-oxygen conditions, along with a reduced level of the antifungal compound 5,6-dimethylbenzimidazole. 外代谢组分析显示，在低氧条件下，溶血磷脂酰乙醇胺(lysoPE)和N-乙酰苯丙氨酸的积累增加，同时抗真菌化合物5，6-二甲基苯并咪唑的水平降低。 

（9）These responses reflect physiological and metabolic plasticity of Flavobacterium sp. 98, highlighting significant changes in the expression of specific traits under hypoxic conditions. Our findings provide insights into niche-adaptive strategies of endophytic bacteria and pinpoint functional traits in microbe-plant interactions operating inside plant tissue. 这些反应反映了黄杆菌的生理和代谢可塑性。98，突出了低氧条件下特定性状表达的显著变化。我们的发现为内生细菌的生态位适应策略提供了见解，并精确定位了植物组织内微生物-植物相互作用的功能特征。

展示了甜菜根组织中的氧气梯度，以及内生细菌 Flavobacterium sp. 98 在低氧条件下生长时表现出的表型变化。A. 甜菜根横截面示意图，内容： 一张典型的2周龄甜菜根横截面图。关键标记： 图中的实线和箭头标明了氧气微传感器的探测轨迹，传感器将沿此路径从外部空气刺入根部组织内部进行测量。

B. 根部氧气浓度剖面图，来自四次独立实验的氧气浓度数据汇总图。 在2周龄甜菜幼苗的根-茎连接处（即真菌病原体R. solani通常侵染的部位）下方约1厘米处测量。X轴（深度）： 微传感器刺入根部的深度。Y轴（氧气含量）： 测得的氧气浓度。关键特征：虚线： 标出了当传感器穿过根组织时，从空气到皮层，再到中柱（维管束区） 的大致边界。趋势： 氧气浓度随着传感器进入根组织急剧下降，在内部组织（尤其是中柱）中维持在一个很低且波动的水平。这直接证明了根内部存在缺氧微环境。

C. 低氧对细菌生长的影响（生长曲线）。内容： Flavobacterium sp. 98 在常氧和低氧条件下的生长曲线。坐标轴：X轴： 培养时间（小时）。Y轴： 培养物的光密度（OD600），代表细菌的生长量。 与常氧条件相比，在低氧条件下，细菌的生长速度明显减慢，最终生物量也更低。这表明低氧限制了其生长。

D. 不同时长低氧暴露对最终生长的影响，一个更精细的实验，考察不同持续时间低氧处理对细菌最终生长的影响。实验设计： 将所有培养板同时接种，其中一半放入低氧室。在培养4、6、8、24和31小时后，分别将一些培养板从低氧室取出，移回常氧条件，直到接种后31小时统一测量最终OD600。X轴： 在低氧条件下暴露的时长（小时）。Y轴： 接种31小时后的最终光密度（OD600）。结论： 图中显示，低氧暴露时间越长，31小时时的最终生长量越低。这表明低氧对生长的抑制效应是累积且持续的，即使后续恢复常氧，也无法完全弥补早期的生长损失。E & F. 表型对比图片内容： 展示低氧如何改变细菌菌落形态及其与病原菌的相互作用。E图： 对比 Flavobacterium sp. 98 在常氧和低氧条件下培养的菌落。可以看出，低氧条件下的菌落扩散得更开、更薄。F图： 展示 Flavobacterium sp.98 对病原真菌R. solani菌丝生长的抑制情况。图中显示，低氧条件下培养的细菌，其抑制区似乎更明显。G & H. 表型变化的定量分析。内容： 对E和F图中观察到的现象进行量化，并用统计学验证。G图（运动性）：Y轴： 菌落扩散的直径。结论： 低氧条件下，细菌的滑动运动性显著增强（菌落铺得更大）。这解释了E图中观察到的菌落形态变化。H图（抑菌能力）：Y轴： 相对于没有细菌的对照组，对R. solani菌丝生长的抑制百分比。结论： 低氧条件下培养的 Flavobacterium sp. 98，其抑制病原真菌生长的能力显著增强。这量化并证实了F图中的观察。共同点： 两图均使用柱状图表示，带有误差线，并标注了统计学显著性。

图2 整体主题： 研究内生细菌 Flavobacterium sp. 98 对氧气限制的代谢响应，重点关注其胞外代谢物谱（外代谢组）的变化。A. 主成分分析图，目的： 从整体上判断低氧条件是否显著改变了细菌的胞外代谢物谱。原理： PCA是一种降维统计方法，能将复杂的多变量数据（此处是5305个质谱特征）的主要差异表现在二维图上。距离越远的样本，其代谢组成差异越大。常氧和低氧条件下的样本在PC1轴上清晰地分成了两个集群。PERMANOVA结果 (R² = 0.49, P = .028)： 这是关键统计检验。它表明“氧气条件”这个分组变量解释了代谢物组成49.7%的变异，且这种差异具有统计学显著性。简单说，低氧导致了代谢组的根本性改变。PERMDISP结果 (F = 0.077, P = .776)： 这检验了组内离散度是否相同。P值大于0.05，说明两组样本内部的变异程度相似，因此PCA图上看到的组间差异不是由于数据分散程度不同造成的，而是真实的组间差异。结论： 低氧条件显著且深刻地重塑了 Flavobacterium sp. 98 的胞外代谢物组成。

B. 差异丰度质谱特征热图，目的： 直观展示在众多变化的代谢物中，哪些是显著差异的，并呈现其变化模式。图中信息：行： 254个符合筛选标准（倍数变化>2，FDR校正P值<0.05）的显著差异质谱特征。列： 每个条件下的4个生物学重复样本。颜色： 红色代表在该样本中相对丰度高，蓝色代表低。结论： 可以清晰地看到，大部分行的颜色在常氧组和低氧组之间呈现一致的、相反的模式（例如，左边四列为蓝，右边四列为红），这强有力地证实了代谢重编程的系统性，且实验重复性良好。

C. 火山图，目的： 在统计显著性和变化幅度两个维度上，展示所有被检测代谢物的变化情况，并突出关键代谢物。坐标轴：X轴 (Log₂ Fold Change)： 变化倍数（低氧 vs 常氧）的对数值。越靠右，表示在低氧下积累越多；越靠左，表示积累越少。Y轴 (-Log₁₀ P-value)： 显著性水平的对数值。点越高，表示差异越显著。图中区域：两侧的散点： 落在灰色虚线阈值外的点，就是显著差异的代谢物。“Up” (111个)： 在低氧条件下丰度显著升高的代谢物。“Down” (143个)： 在低氧条件下丰度显著降低的代谢物。

突出显示的关键代谢物：5,6-二甲基苯并咪唑： 一个已知的抗真菌化合物。它在低氧下丰度降低（位于左侧），这与图1H中抑菌能力增强看似矛盾，暗示可能有其他更关键的抑菌物质起主导作用。N-乙酰苯丙氨酸： 一种氨基酸衍生物，在低氧下积累（位于右侧）。1-16:0-溶血磷脂酰乙醇胺： 一种溶血磷脂，在低氧下强烈积累（最右侧的点之一）。这类物质与膜流动性、信号传导等有关。结论： 直观地展示了代谢变化的全局图景，并锁定了几个值得深入研究的特异性代谢物。

D. 化合物注释点图，目的： 对差异代谢物进行化学分类学注释，揭示低氧引发的代谢变化主要发生在哪些化学类别或生物合成途径中。坐标轴与图例：Y轴： 化合物被注释到的化学类别/天然产物途径（例如，脂质、氨基酸、苯类化合物等）。X轴： CANOPUS注释概率。越靠右，表示该质谱特征被注释到特定化学类别的可信度越高。点的大小： 表示该代谢物的变化倍数（绝对值），点越大，变化越剧烈。点的颜色和文字： “Up”代表低氧下丰度升高（红色），“Down”代表降低（蓝色）。图中信息：点主要集中在图的右侧，说明对大部分差异代谢物的注释可信度较高。点分布在不同高度的化学类别中，表明低氧的影响是广泛的，涉及多种代谢途径。可以观察哪些化学类别下聚集了更多或更大的“Up”或“Down”点，从而推断哪些类型的代谢在低氧下被整体激活或抑制（例如，可能看到脂质类化合物有很多大的“Up”点，这与LysoPE的积累相符）。结论： 提供了对代谢重编程的机制性见解，指明了受到低氧调节的主要代谢网络和化学物质类型，为后续功能研究提供了线索。

Oxygen plays a crucial role in shaping microbial physiology, functions, and behavior 氧气在塑造微生物的生理、功能和行为方面起着至关重要的作用 .Endophytic bacteria, residing within plant tissues, inhabit microenvironments where oxygen availability can be limited. 内生细菌存在于植物组织中，栖息在氧气有限的微环境中。 However, the magnitude of hypoxic conditions in the endosphere and how these affect functional microbial traits are largely unknown. 然而，内球层中缺氧条件的程度以及这些如何影响功能性微生物特征在很大程度上是未知的。