（1） Fl98 细菌能保护甜菜根部免受真菌 Rhizoctonia solani 的侵害，并且这种保护作用依赖于一个名为 BGC298 的基因簇

（2）BGC298 的作用： 通过代谢组学比较分析发现，当敲除 BGC298 基因簇后，Fl98 产生的抗真菌化合物 DMB 减少了。因此，研究人员提出假设：BGC298 通过调节 DMB【6-二甲基苯并咪唑】 的生物合成来帮助植物抗病。 随后，他们定点突变了负责合成 DMB 的基因 bluB（DMB合成酶基因）。结果，Fl98 完全无法产生 DMB。在温室实验中，无论是 ΔBGC298 突变菌株还是 ΔbluB 突变菌株，都失去了保护甜菜幼苗的能力。这直接证明了 DMB 是 Fl98 发挥保护作用的关键武器

（3）bluB 基因在 Flavobacterium 属细菌中广泛存在。而 BGC298 基因簇只存在于一小部分与植物相关的菌株中。这表明，BGC298 可能是某些植物共生菌特有的、用于增强其共生和防病功能的“高级装备”。

（1）Endophytic microorganisms colonize internal plant tissues and enhance host resistance to pathogens. 内生微生物定居在植物内部组织并增强宿主对病原体的抗性。

（2）We previously showed that endophytic Flavobacterium sp. 98 (Fl98) protects sugar beet against the fungal root pathogen Rhizoctonia solani via biosynthetic gene cluster 298 (BGC298). 我们之前发现内生黄杆菌。98 (Fl98)通过生物合成基因簇298 (BGC298)保护甜菜对抗真菌根病原体立枯丝核菌。

（3）However, the molecular mechanisms underlying this protection remained poorly understood. 然而，这种保护的分子机制仍然知之甚少。  

（4）Here, comparative metabolomic analyses revealed that knockout of BGC298 led to reduced production of the antifungal compound 5,6-dimethylbenzimidazole (DMB) in Fl98. 这里，比较代谢组学分析显示敲除BGC298导致Fl98中抗真菌化合物5，6-二甲基苯并咪唑(DMB)的产生减少。 

（5）We hypothesized that BGC298 is involved in regulating DMB biosynthesis and therefore contributes to Fl98’s disease suppression as a novel protective mechanism. 我们假设BGC298参与调节DMB的生物合成，因此作为一种新的保护机制有助于Fl98的疾病抑制。 

（6）Subsequent site-directed mutagenesis of the DMB-synthase gene bluB abolished DMB production by Fl98, and both ΔBGC298 and ΔbluB mutants were compromised in protecting sugar beet seedlings in greenhouse bioassays. 随后对DMB合酶基因bluB的定点突变消除了Fl98产生的DMB，BGC298和δbluB突变体在温室生物测定中保护甜菜幼苗时都受到了损害。

（7）Bioinformatic analyses further indicated that bluB is widespread across Flavobacterium, while BGC298 is limited to a small subset of plant-associated strains. Together, our findings highlight the pivotal role of BGC298 and DMB biosynthesis in plant protection by endophytic Flavobacterium sp. 98. 生物信息学分析进一步表明，bluB广泛存在于黄杆菌中，而BGC298仅限于一小部分植物相关菌株。总之，我们的发现强调了BGC298和DMB生物合成在内生黄杆菌植物保护中的关键作用。

（8）Result

（9）Comparative metabolomics reveals reduced DMB production by ΔBGC298 比较代谢组学揭示BGC298减少了DMB的产生

A. 火山图 - 筛选差异代谢物，目的： 全局性、无偏见地比较两种菌株代谢产物的差异。X轴（Log2 Fold Change）： 表示代谢物在突变体（ΔBGC298）与野生型（WT）中含量的对数倍数变化。数值大于0（蓝色点）表示在突变体中含量升高；小于0（红色点）表示降低。Y轴（-Log10 FDR）： 表示差异的统计学显著性。值越大（点越高），差异越显著。关键点： 图中有大量红点（显著下调的代谢物），说明敲除 BGC298 基因簇严重影响了细菌的代谢产物的合成。其中，一个标记为橙色的点被特别突出，它就是研究人员后续关注的 DMB。它在突变体中含量显著降低（位于左侧），且差异非常显著（位于上部）。B. 靶向LC-MS柱状图 - 定量验证DMB产量。目的： 专门针对DMB这个化合物进行精确定量，验证火山图的发现。直接测量DMB的峰面积（代表相对含量）。结果显示，ΔBGC298 突变体产生的 DMB 量远低于野生型（WT）。这直接证明了 BGC298 基因簇对 DMB 的生物合成至关重要。C. MS/MS质谱图 - 结构鉴定，目的： 确认细菌提取物中的目标化合物在化学结构上就是纯品的DMB。将细菌提取物中对应的峰（下图）与纯品DMB标准品（上图）进行二级质谱碎裂比对。两条谱线的碎片峰（m/z）完全一致，就像“化学指纹”匹配成功。这提供了确凿证据，证明细菌产生的化合物就是 DMB，而非其他质量数相近的物质。D. 化学结构式 - 展示分子结构，目的： 直观展示被鉴定出的化合物DMB的化学结构。解读：显示了5,6-二甲基苯并咪唑的平面结构式。它是一个苯环与一个咪唑环并联（苯并咪唑），并在5号和6号碳原子上各连接一个甲基（-CH₃）。E. 平板抑菌实验 - 验证生物活性，目的： 证明鉴定出的DMB化合物具有抑制病原真菌生长的生物学功能。解读：在含有不同浓度DMB的琼脂平板上培养病原真菌 Rhizoctonia solani。结果清晰显示，DMB浓度越高，对真菌菌丝生长的抑制圈越大。这直接验证了 DMB 具有剂量依赖性的抗真菌活性，从而在功能上解释了为什么产生DMB的Fl98菌能够保护植物。

（10） DMB exhibits antifungal activity in a concentration-dependent manner DMB以浓度依赖的方式显示抗真菌活性

（11） Genetic basis of DMB biosynthesis in Fl98 and role in disease protection Fl98 DMB生物合成的遗传基础及其在疾病保护中的作用

在Fl98细菌中确认哪个基因是真正的 bluB（DMB合成酶基因），并验证该基因对DMB合成和生物防治功能的关键作用

A. 表格 - 候选基因筛选，目的： 通过生物信息学方法，在Fl98的基因组中寻找可能与DMB合成酶（BluB）同源的基因。查询序列是一个已被实验验证的bluB基因（来自另一项研究）。表格列出了三个候选基因（ID: 98_02485, 98_06510, 98_02510），它们与查询序列有不同程度的相似性。关键指标：Identity（%）： 氨基酸序列一致性。98_06510 一致性最高（32.979%）。

B. 色谱图 - 验证DMB合成功能，目的： 通过基因敲除实验，验证哪个候选基因真正负责DMB的合成。 只有敲除 98_06510（即 bluB） 的突变体（KO 98_06510）完全失去了DMB峰。其他两个基因的敲除突变体仍能正常产生DMB。结论： 98_06510基因确实是Fl98中负责DMB合成的 bluB 基因。功能实验验证了生物信息学的预测。

C图（定量）： 柱状图显示病原真菌R. solani的菌丝生长量。敲除bluB的突变体（ΔbluB）的抑菌能力显著下降（与ΔBGC298相似），远不如野生型（WT）。不同字母（a, b, c）代表统计学上的显著差异。

D图（定性）： 平板照片直观展示了这一结果。在野生型（WT）菌落周围，真菌生长被强烈抑制（出现明显的抑菌圈），而ΔbluB和ΔBGC298突变体周围的抑制效果很弱或没有。结论： bluB 基因是Fl98产生体外抗真菌活性的必要条件。

E. 温室病害实验 - 验证体内保护功能。目的： 在真实的植物-病原菌互作系统中，验证bluB基因对植物保护是否必需。柱状图显示了甜菜幼苗发生猝倒病的发病率（%）。关键结果：用野生型Fl98处理时，病害发生率最低，保护效果最好。用ΔbluB突变体处理时，保护效果完全丧失，发病率与阴性对照（Control，仅病原菌） 一样高。

（12） Regulation of bluB and BGC298 in endophytic Flavobacterium Fl98 内生黄杆菌Fl98中bluB和BGC298的调控

（13） Distribution of bluB and BGC298 in the genus Flavobacterium bluB和BGC298在黄杆菌属中的分布

展示了 BGC298 和 bluB 这两个基因在黄杆菌属（Flavobacterium） 中的进化与分布情况。

A. 基因排列图 - 展示基因结构。目的： 直观展示 bluB 和 BGC298 在Fl98基因组上的位置和结构。上图显示BGC298是一个杂合的NRPS-PKS基因簇。NRPS（非核糖体肽合成酶） 和 PKS（聚酮合酶） 是细菌合成复杂天然产物的两大“分子工厂”。这解释了BGC298可能负责合成一个复杂的调控分子。基因簇的长度约为20kb（从约955kb到975kb）。下图显示bluB 是一个独立的基因，位于基因组的另一个区域（约1.566Mb处）。关键信息： bluB（负责合成最终武器DMB）和 BGC298（可能负责合成调控因子）在基因组上是物理分离的，这支持了“BGC298调控 bluB”的假设，而不是直接参与DMB合成。

B. 序列相似性与覆盖度散点图 - 设定同源基因判定标准，目的： 为在整个黄杆菌属中搜寻 bluB 和 BGC298 的同源基因设定一个客观、统一的阈值。每个点代表一个黄杆菌基因组中与查询序列（bluB 或 BGC298-PKS）的比对结果。X轴（Coverage，覆盖度）： 目标序列与查询序列比对上的区域百分比。覆盖度低意味着只匹配了一小段，可能不是完整的功能基因。Y轴（Sequence Similarity，序列相似性）： 比对上的区域中，氨基酸序列的一致性百分比。相似性低意味着基因虽存在但可能已分化出不同功能。颜色（E value）： 比对的统计学显著性。虚线阈值： 研究人员设定了一个保守的判定标准：覆盖度 > 70% 且 序列相似性 > 25% 的基因，才被认为是真正的同源基因。高于此阈值的点（图中右上角区域）对应的基因组，才会在C图中被标记为“拥有该基因”。

C. 系统发育树与基因分布环图 - 揭示进化与生态分布模式， 将基因的分布模式映射到黄杆菌属的系统进化关系上，以推断其进化历史和生态关联。树结构： 基于基因组构建的黄杆菌属系统发育树，展示了不同菌株间的进化亲缘关系。F. psychrophilum 和 F. columnare 是两个重要的鱼类病原菌分支，被折叠显示以简化视图。尖端颜色： 代表菌株的分离来源（生态位）。可以看出，黄杆菌广泛分布于植物、土壤和其他环境。内环（BluB）： 显示 bluB 基因的分布。拥有该基因的菌株（根据B图的阈值判定）对应的分支被着色。bluB 广泛存在于整个黄杆菌属的多个分支中，且不局限于特定生境。外环（BGC298-PKS）： 显示 BGC298基因簇的分布。拥有该基因簇的菌株对应的分支被着色。BGC298的分布非常狭窄，仅存在于系统发育树上一个特定的、较小的分支中。关键位置（星标 ★）： 本研究的主角 Fl98 被特别标出。它位于一个同时拥有 bluB 和 BGC298 的小分支中，且这个分支的成员主要来源于植物（绿色）。

A. 局部系统发育树与基因相似性热图，目的： 在拥有BGC298同源基因簇的菌株子集中，分析该基因簇内部各个基因的进化模式。左侧系统发育树： 这是从图3C中提取出的一个小分支，包含了所有拥有BGC298同源基因的黄杆菌菌株。这些菌株在进化上亲缘关系很近。尖端颜色： 再次强调了这些菌株主要来源于植物（绿色），少数来自土壤（黄色），与图3C的发现一致，强化了BGC298与植物共生的关联。右侧热图： 展示了BGC298基因簇内部多个基因（行）在不同菌株（列）中的序列相似性。颜色越亮（黄/白），相似性越高；颜色越暗（蓝/黑），相似性越低。核心生物合成基因（PKS和NRPS模块）： 热图的纵坐标（行）： 是BGC298基因簇内部的各个基因（包括核心的PKS/NRPS模块基因和其他附属基因）？在热图中被高亮标出。可以看到，这些负责合成“分子工厂”核心结构的基因（PKS/NRPS）在几乎所有菌株中都保持高度相似（颜色明亮、均一）。非核心基因： 热图中其他非高亮的行，显示出更大的变异（颜色斑驳、有暗色区域）。这些基因可能编码修饰酶、调控因子或转运蛋白等附属功能。结论： 在拥有BGC298的菌株中，其核心的合成机器（PKS/NRPS模块）是高度保守的，表明它们可能生产结构相似的化合物。而外围基因的多样化，可能使不同菌株能对产物进行微调，或适应不同的微环境。

B. 基因簇家族（GCF）系统发育网络图，目的： 将BGC298放到一个更广阔的“天然产物基因簇宇宙”中，看它属于哪个家族，以及这个家族有多独特。 研究者从NCBI数据库中504个黄杆菌基因组里，总共预测出了 307个 PKS-NRPS杂合基因簇（这是一个很大的天然产物库）。分析工具： 使用 BiG-SCAPE 软件，根据基因含量和序列相似性，将这307个基因簇进行分类，聚合成不同的基因簇家族（Gene Cluster Families， GCFs）。网络图： 每个节点代表一个基因簇，节点之间的连线表示它们被归类到同一个GCF中（相似性阈值 > 0.7）。节点大小和颜色可能代表其他属性（如来源）。核心发现： 在这307个基因簇中，只有23个（占比约7.5%）与Fl98的BGC298高度相似，被归为同一个GCF（即图中BGC298所在的这个网络）。BGC298的位置： 本研究的BGC298（已高亮）位于这个由23个成员组成的小网络之中。结论： BGC298所代表的这类基因簇在黄杆菌属中非常罕见和独特。它不是一个常见的PKS-NRPS类型，而是一个小而特化的基因簇家族。这进一步支持了其功能可能与特定的生态适应（如植物共生）相关。

该模型阐明了内生菌 Flavobacterium sp. 98 保护植物的两级防御系统，并揭示了其进化生态学意义。

第一级：核心武器系统（广泛存在的工具），基因： bluB，功能： 直接催化合成抗真菌化合物 DMB。这是对抗病原菌（Rhizoctonia solani）的直接“武器”。证据： ΔbluB 突变体完全无法产生DMB，并彻底丧失保护能力。进化分布： 该基因在黄杆菌属中广泛存在，表明生产DMB的能力可能是该属细菌的一个古老或基础的代谢特征。第二级：精密调控系统（特化的高级装备），基因： BGC298（一个NRPS-PKS杂合基因簇）功能： 正调控 bluB 的表达或DMB的合成效率。它本身不生产DMB，而是像一个“调控开关”或“增效器”，确保在适当的时间、地点生产足量的DMB。证据： ΔBGC298 突变体仍能产生DMB，但产量显著低于野生型，其保护能力也随之减弱。进化分布： 该基因簇仅存在于一小部分黄杆菌中，这些菌株主要与植物和土壤环境相关。

R免费在线作图工具介绍 微生物组学数据 R作图工具平台测试上线

往期作图教程介绍 （1） 绘图指南：差异物种分组相对丰度分析图（热点与柱状图的组合）

（1）Endophytic microorganisms colonize internal plant tissues and enhance host resistance to pathogens. 内生微生物定居在植物内部组织并增强宿主对病原体的抗性。

（2）We previously showed that endophytic Flavobacterium sp. 98 (Fl98) protects sugar beet against the fungal root pathogen Rhizoctonia solani via biosynthetic gene cluster 298 (BGC298). 我们之前发现内生黄杆菌。98 (Fl98)通过生物合成基因簇298 (BGC298)保护甜菜对抗真菌根病原体立枯丝核菌。

（3）However, the molecular mechanisms underlying this protection remained poorly understood. 然而，这种保护的分子机制仍然知之甚少。