老问题：接种的固氮菌很难在植物根部有效定殖 → 新思路：派一个“工程粘合剂细菌”先去根部“占位” → 新工具：“粘合剂细菌”能抓住根部分泌的多糖，并帮助固氮菌附着，好结果：固氮菌成功定殖，土壤肥力和植物产量双双提升。EcCMC：大肠杆菌BL21菌株（Cmc蛋白的结构是：[结合域] - [荧光蛋白] - [结合域]。 这使得EcCMC既能发出红光便于观察，又能通过两端的“钩子”强力结合植物根系表面的多糖。）

Background

（1）Nitrogen-fixing bacteria (NFBs) play a critical role in biological nitrogen fixation for supplying essential nitrogen nutrients to plants in agriculture and natural ecosystems. 固氮细菌在生物固氮中起着重要作用，为农业和自然生态系统中的植物提供必需的氮营养。

（2）  Especially, these bacteria and Leguminosae plants form symbiosis to improve plant growth and soil fertility. 特别是，这些细菌和豆科植物形成共生关系，以改善植物生长和土壤肥力。

（3）Theoretically, the inoculation of NFBs into soils increases biological nitrogen fixation, but the efficiency of NFBs is frequently compromised by the low capacity of NFB root colonization 理论上，将NFBs接种到土壤中增加了生物固氮，但是NFBs的效率经常受到NFB根定殖能力低的影响 .

（4）In this study, we introduced the synthetic bacterium EcCMC, which was genetically engineered to express the surface-displayed artificial polysaccharide (PS)-recognizing protein Cmc, to test if it can improve NFBs root colonization in representative Leguminosae plants, including Astragalus sinicus and Medicago sativa. 。在本研究中，我们引入了合成细菌EcCMC，该细菌经基因工程改造后表达表面展示的人工多糖(PS)识别蛋白CMC，以测试其是否能提高代表性豆科植物(包括紫云英和紫花苜蓿)中NFBs的根定殖。  

（5）Rhizosphere microbiomes, biochemical indicators, and plant yields were evaluated after 28 days in the three treatments, i.e., the control group without addition of any exogenous bacterium, the NFBs plus EcM (bacteria only expressing mCherry rather than Cmc) group, and the NFBs plus EcCMC group (n=3). 28天后，在三个处理中评估根际微生物群、生化指标和植物产量，即不添加任何外源细菌的对照组、NFBs加EcM(仅表达mCherry而非Cmc的细菌)组和NFBs加EcCMC组(n = 3)。

（6）Owing to its polysaccharide-binding capacity, EcCMC strongly bound to the surface of A. sinicus roots. This binding was followed by the increased recruitment of the exogenous NFBs, Sinorhizobium meliloti and Sphingomonas endophytica, on the roots. 由于其多糖结合能力，EcCMC强烈地结合到紫云英根的表面。这种结合之后，外源NFBs，苜蓿中华根瘤菌和内植鞘氨醇单胞菌在根上的补充增加。  

（7）As revealed by amplicon sequencing of the 16S rRNA gene, a combined inoculation of EcCMC and the NFBs increased the relative abundance of both Rhizobiales and Sphingomonadales, two important bacterial groups involved in nitrogen fixation. Consistently, metabolomic analysis showed that the metabolites involved in nitrogen fixation remarkably accumulated in the rhizosphere soils inoculated with NFBs plus EcCMC. 正如16S rRNA基因的扩增子测序所揭示的，EcCMC和NFBs的组合接种增加了根瘤菌和鞘氨醇菌的相对丰度，这两个细菌群是参与固氮的两个重要细菌群。代谢组学分析表明，参与固氮的代谢产物在接种NFBs和EcCMC的根际土壤中显著积累。 

（8）Moreover, inoculation of NFBs plus EcCMC increased the activity of nitrogenase from 10.8~11.3 to 16.2 nmol/min/g (significant difference, p<0.05, t-test), together with the total soil nitrogen levels from 217~258 to 414 mg/kg (significant difference, p<0.05), and the soil organic matter levels from 19.5~20.8 to 23.6 mg/kg (significant difference, p<0.05). Consequently, the yield of A. sinicus was remarkably improved by the inoculation of NFBs plus EcCMC. Similar results were observed in the experiments using Medicago sativa. 此外，接种NFBs+EC CMC使固氮酶活性从10.8 ~ 11.3 nmol/min/g提高到16.2 nmol/min/g(显著差异，p < 0.05)，土壤全氮水平从217 ~ 258mg/kg提高到414 mg/kg(显著差异，p < 0.05)，土壤有机质水平从19.5 ~ 20.8mg/kg提高到23.6 mg/kg(显著差异，p < 0.05)。因此，接种NFBs和EcCMC显著提高了中华按蚊的产量。在使用紫花苜蓿的实验中观察到类似的结果。 

（9）This study sheds a novel light on a synthetic biology-assisted regulation of rhizosphere microbiomes for enhanced nitrogen fixation and soil fertility in Leguminous plants. The designed polysaccharide-binding protein may be used as a universal tool to promote plant growth and enhance crop resilience in the future. 这项研究为合成生物学辅助调控豆科植物根际微生物以增强固氮和土壤肥力提供了新的思路。所设计的多糖结合蛋白可能在未来被用作促进植物生长和增强作物弹性的通用工具。

（10） Result

（11） Exogeneous NFB fails to efficiently colonize rhizosphere soil外源固氮菌未能有效定殖于根际土壤

（12） The synthetic bacterium EcCMC strongly binds polysaccharide-exposed NFBs合成细菌EcCMC强力结合暴露于多糖的固氮菌

（13） EcCMC improves root recruitment and colonization of exogenous NFBEcCMC促进外源固氮菌的根部招募与定殖

可视化并定量证明工程菌EcCMC如何帮助固氮菌（NFBs）在紫云英根部附着（招募）和定殖（稳定存在）a. 激光共聚焦显微镜图像 (处理1小时后)目的：直观展示初始招募和附着效果。内容：图中用不同荧光标记了两种细菌。EcM (对照组)：仅表达红色荧光蛋白（mCherry）的“无效”工程菌。EcCMC (实验组)：表达多糖结合蛋白（Cmc）的“有效”工程菌。NFBs (固氮菌)：可能用绿色荧光标记。b. 根部结合细菌百分比 (基于CFU计数，处理1小时后)，目的：定量评估初始附着在根部的细菌数量。方法：将处理1小时后的根系取出、清洗，将洗脱下来的悬浮液进行菌落形成单位（CFU）计数，计算附着在根上的细菌占总接种细菌的百分比。关键信息：NFBs+EcCMC组的柱状图高度会显著高于NFBs+EcM组（标有星号*），证明EcCMC的存在使更多固氮菌在短时间内结合到了根表。c. 扫描电子显微镜图像 (培养48小时后)，目的：观察细菌在根表长期定殖的微观形貌和空间分布。红色方框区域：被放大显示在下方的小图中，以便观察细节。白色箭头：在放大的图像中，明确指示了固氮菌（NFBs） 在根表或EcCMC菌膜中的具体位置。d. 根部定殖细菌百分比 (基于CFU计数，培养48小时后)目的：定量评估经过较长时间（48小时）后，稳定定殖在根部的活菌数量。方法：将培养48小时后的整条根进行研磨，对研磨液进行CFU计数，计算定殖在根内的细菌数量。关键信息：NFBs+EcCMC组的柱状图会显著高于对照组（标有星号*）。这直接证明，EcCMC不仅帮助固氮菌初始附着（图b），更能帮助它们长期、稳定地存活和繁殖在根际，完成了从“招募”到“定殖”的全过程。

（14） EcCMC and exogenous NFB drastically remodel rhizosphere microbiome EcCMC与外源固氮菌显著重塑根际微生物组

EcCMC不仅帮助了外源固氮菌定殖，还更广泛地改造了根际微生物群落结构，使其向着更健康、更稳定、更有利于固氮功能的方向发展。

a. 根际微生物组的辛普森指数。关键信息：预计 NFBs+EcCMC组 的辛普森指数会显著高于其他组。、

b. 根际细菌群落的相对丰度（柱状图），展示整体细菌群落组成在门或纲水平上的变化。关键信息：可以观察到三组样品的群落组成存在差异。特别是 NFBs+EcCMC组 中，与固氮相关的类群（如变形菌门中的根瘤菌等） 的占比可能会显著增加，这为后续的功能提升提供了群落结构基础。

c图：对具有生物膜形成能力的细菌（如鞘氨醇单胞菌目、黄单胞菌目等）的丰度进行统计分析。

d图：用柱状图直观展示这些生物膜相关菌目在各组中的相对比例。NFBs+EcCMC组 中，这些生物膜形成菌的丰度会显著提高。这强烈暗示，EcCMC作为“锚点”，可能为这些细菌提供了附着基础，促进了根表有益微生物生物膜的形成。生物膜能保护菌群、增强抗逆性、促进物质交换，是稳定和功能化根际微生物组的关键。

e. 根际土壤中NFBs的数量（CFU计数）直接定量验证外源固氮菌在28天后是否仍在根际土壤中成功存留和繁殖。NFBs+EcCMC组 的CFU计数会显著高于NFBs+EcM组。这是对图1d（根部定殖）的延伸和确认，证明在长期、开放的土壤环境中，EcCMC的辅助效应依然有效，确保了外源固氮菌的持久性和高种群密度。

f. 根际真菌群落的相对丰度

目的：评估处理对根际真菌群落的影响。真菌在养分循环、病原抑制等方面也起着重要作用。

（15） EcCMC and exogenous NFBs influence rhizosphere metabolism of A. sinicus EcCMC与外源固氮菌影响紫云英根际代谢

EcCMC的辅助，极大地激活了根际土壤的代谢活性，特别是显著富集了与氮代谢、氨基酸合成等关键生物过程相关的通路，从生化功能上解释了土壤改良的原因。

a图 (EcCMC组 vs 对照组)：预期两点云会明显分离，表明EcCMC处理强烈且全面地改变了根际土壤的代谢物组成。b图 (EcCMC组 vs EcM组)：预期两点云也会显著分离。这至关重要，它证明代谢组的改变不是由“多了一个细菌（EcM）”引起的，而是特异性由EcCMC的“粘附/招募”功能所驱动的。

c & d. 差异代谢物火山图，目的：在整体差异的基础上，具体找出哪些代谢物发生了显著变化，以及变化的幅度。横坐标：变化倍数（Fold Change, FC）。通常以log2(FC)表示，越靠右表示在实验组中含量上调越多（FC > 1）；越靠左表示下调越多（FC < 1）。e & f. 代谢通路富集图，目的：这是最关键的解读环节，回答“这些变化的代谢物到底参与了哪些生物学过程？”将火山图中鉴定出的差异代谢物，映射到已知的生物代谢通路上（如KEGG数据库）。

（16） EcCMC and exogenous NFBs promote soil fertility and growth of A. sinicusEcCMC与外源固氮菌提升土壤肥力并促进紫云英生长

在根际微生物群落和代谢功能得到优化后，植物根系本身也表现出更健康、更发达的形态结构，这直接奠定了其吸收更多养分、实现更高产量的基础。

健康的根系带来了健康的地上部分。经过EcCMC辅助的处理，紫云英植株整体生长更旺盛，叶片光合能力更强，营养更丰富，最终实现了增产提质。a. 株高，b. 鲜重，c. 叶面积，d. 叶绿素a和b含量，e. 叶片氮、磷、钾含量. f. 可溶性蛋白含量, g. 叶片扫描电镜图像

（17） EcCMC and exogenous NFBs promote growth of Medicago sativa EcCMC与外源固氮菌促进紫花苜蓿生长

这张图非常重要，它在另一种重要的豆科植物——紫花苜蓿上重复并验证了整个研究的核心发现，证明了EcCMC辅助固氮菌策略的普适性和应用潜力。a & b. 根际微生物群落组成（细菌与真菌）。a图（细菌）：预计 NFBs+EcCMC组 中，与固氮或生物膜形成相关的有益细菌类群（如根瘤菌目、鞘氨醇单胞菌目）的相对丰度会显著增加。b图（真菌）：真菌群落结构也会发生改变，可能朝着更健康的方向发展（如增加有益真菌）。c. 根际土壤中固氮菌数量（CFU计数）直接定量验证在紫花苜蓿根际，外源固氮菌是否成功定殖并维持高种群密度。关键信息：NFBs+EcCMC组 的CFU计数会显著高于NFBs+EcM组。这重复了图2e的关键结果，证明EcCMC的“锚定”作用在不同植物宿主上依然有效。d, e, f. 土壤关键肥力指标，这三个图是土壤功能提升的核心证据。d. 土壤固氮酶活性：这是生物固氮强度的直接度量。NFBs+EcCMC组 的酶活性会显著最高，表明根际的固氮“机器”在高效运转。e. 土壤全氮含量：这是固氮效果的最终体现。NFBs+EcCMC组 的全氮含量会显著提升，证明固定的氮素有效地留在了土壤中。f. 土壤有机质含量：这是土壤综合肥力和健康度的标志。NFBs+EcCMC组 的有机质含量也会显著增加，这得益于微生物活性增强和植物残体（如根系分泌物、凋落物）的增加。g. 培养植物的代表性图像，最直观地展示不同处理下紫花苜蓿植株的整体生长状况差异。关键信息：NFBs+EcCMC组 的植株在大小、茂密程度、叶片颜色（更绿）上，会明显优于其他两组，为后续的定量指标提供了视觉佐证。h & i. 植株生长指标，目的：定量评估对植物生长的促进效果。h. 株高：NFBs+EcCMC组 的株高会显著更高。i. 鲜重：NFBs+EcCMC组 的地上部分鲜重会显著最重，直接证明了增产效果。j. 叶片扫描电镜图像，微观验证紫花苜蓿叶片的健康状况。关键信息：NFBs+EcCMC组 的叶片应显示更健康的结构（如饱满的表皮细胞、正常的气孔），表明植株生理状态良好，没有因营养缺乏或胁迫而受损。

Theoretically, the inoculation of NFBs into soils increases biological nitrogen fixation, but the efficiency of NFBs is frequently compromised by the low capacity of NFB root colonization 理论上，将NFBs接种到土壤中增加了生物固氮，但是NFBs的效率经常受到NFB根定殖能力低的影响 .